基因组DNA的提取(赛百盛).docVIP

基因组DNA 的提取采用上海赛百盛公司的UltraPureTM 基因组DNA提取试剂盒。具体步骤如下： （1）将1.5ml培养过夜的ZJ3721菌液13000rpm离心30秒，收集菌体，将菌体悬浮于0.5ml PBS缓冲液或TE缓冲液中。 （2）加入1ml纯化树脂中（使用前充分混匀），颠倒混匀5-6?次。室温下温育3分钟，其间颠倒混匀一次，5000rpm离心3秒，收集沉淀。 （3）用1ml GN结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀，5000rpm离心3秒，收集沉淀。 （4）用0.5ml漂洗液漂洗纯化树脂两次，颠倒混匀，5000rpm离心3秒，收集沉淀。如果纯化树脂仍然呈现黄色或褐色，重复第3步一次。 （5）用0.8ml无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱，12000rpm离心1分钟，倒掉废液收集管中的乙醇，再离心1分钟，尽量除尽乙醇。 （6）将纯化柱套入一个干静的1.5ml或2ml离心管中，加入100μl TE缓冲液或无菌超纯水于纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3分钟，12000rpm离心2分钟。如果对基因组DNA的需求量较大的话，则重复第5步1~2次，这样可以获得高产量的基因组DNA。 （7）离心管中收集的液体即是洗脱下来的基因组DNA，取2μl电泳（1%琼脂糖，120V，20分钟）检测。 扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统进行拍照及分析。然后戴一次性手套在紫外灯下切取目的 DNA 条带，放置2ml 离心管中并称重 (离心管在放置凝胶前要预先称重)。按 Axygen 公司 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒说明书回收PCR 产物。具体步骤如下： （1） 在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录 2 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg =100 μl 体积）。 （2） 加入 3 个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于 75°C 加热（低熔点琼脂糖凝胶于 40°C 加热），间断混合（每2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约6-8 min）。 * Buffer DE-A 为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。 （3） 加 0.5 个 Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B，混合均匀；当分离的 DNA 片段小于 400bp 时，加入 1 个凝胶体积的异丙醇。 * 加Buffer DE-B 后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。 （4） 吸取步骤 3 中的混合液，转移到 DNA 制备管（置于2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g 离心 1 min。弃滤液。 （5） 将制备管置回 2 ml 离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g 离心30 s，弃滤液。 （6） 将制备管置回 2 ml 离心管，加 700 μl Buffer W2，12,000×g 离心 30 s，弃滤液。以同样的方法再用 700 μl Buffer W2 洗涤一次 12,000×g 离心 1 min。 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。 （7）将制备管置回 2 ml 离心管中，12,000×g 离心 1 min。 （8） 将制备管置于洁净的 1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30 μl Eluent 或去离子水，室温静置 1 min。12,000×g 离心 1 min 洗脱 DNA。 * 将Eluent 或去离子水加热至 65℃ 将提高洗脱效率。大肠杆菌感受态的制备 (1) 吸取100 μl 在 -20℃保存的DH5α 甘油菌涂布于LB 培养基平板上，37℃培养24~48 h，然后挑取已活化菌落在LB 培养基平板上划线稀释，37℃培养过。 (2) 挑取单克隆转至20 ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过，第二天，吸取200μl 菌液至20 ml 新鲜的LB液体培养基中， 37 ℃ 继续振荡培养1~2 h ， 至 OD600 = 0.2~0.4。 (3) 吸取1 ml 菌液至1.5 ml 的灭菌离心管中，在冰上放置 10 min，冷却至 0℃。 (4) 离心收集菌体细胞 (4000g, 4℃, 10min)。倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。 (5) 用 1 ml 冰预冷的 0.1 M CaCl2重新悬浮菌体沉淀，放置于冰上 10 min。 (6) 离心收集菌体 (4000g, 4℃, 10min)。倒出 CaCl2 溶液，将管倒置 1 min 以使残留的 CaCl