基因表达系列分析(SerialAnalysisofGeneExpression.docVIP

SAGE 技术 MRNA 结合到微珠子上(Microscopic Bead and mRNA) mRNA 转录成 DNA(mRNA binds to bait and is copied into DNA) 用酶切开DNA的一小段(An enzyme cuts the DNA) 另一个酶定在DNA末端以便切下一小段(An enzyme locks onto the DNA and cuts off a short tag),这一小段就被视为这个基因的标签 两个标签连在一起(Two tags are linked together) 在末端的定位分子被切掉(Enzymes cut off the Docking Molecules) 都连成一条线(Di-Tags are combined into large concatemers) DNA上所携带的遗传信息，需要通过RNA为中介体，合成出组织和正常生理功能所需要的蛋白质，这个过程被称为基因的表达。在生物体中不同的组织和器官所表达的基因群是不一样的，我们把基因群的表达状况称为基因表达谱。目前，高通量地研究基因表达谱的方法主要有两种，即生物芯片和基因表达串联分析（serial analysis of gene expression, SAGE）。基因芯片所能检测的基因必须是已知的基因，放在芯片上几种基因的探针就只能检测这几种基因的表达谱；相比之下，SAGE能以远高于DNA芯片的精确度和重复性来检测在病理条件下基因表达谱的改变，而不必考虑所检测的基因是已知的还是未知的。因此在检测疾病相关的新基因，特别是无法用基因芯片进行检测的低表达量致病基因时，SAGE是目前的最佳手段，无可取代。 SAGE技术为Genzyme公司所拥有的专利技术。其技术简介如下： SAGE技术得以建立的理论基础 首先，一段来自于任一转录本特定区域的标签（Tag），即长度仅9-14bp的短核苷酸序列，就已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。例如：一个9碱基的序列能有49=262144种不同的排列组合，而人类基因组据估计仅编码80000种转录本，因此在理论上每一个9碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。 第二，如果将短片段标签相互连接、集中形成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理，这样就可对数以千计的mRNA转录本进行批量分析。 第三，各转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数进行定量。 SAGE的主要阶段： 1）以biotin-oligo dT为引物将mRNA反转录合成双链cDNA，以一种锚定酶（Anchoring Enzyme, AE）进行酶切后，收集其cDNA的3端部分。锚定酶通常为识别4碱基位点的III类限制性内切酶，如Nla III、Sau3A I等。由于大多数mRNA的长度要大于44=256个碱基，因此使用这种锚定酶可以保证在每一个转录本上至少有一个酶切位点。 2）将收集的3端cDNA等分为两部分，分别同接头A、B相连接。每一种接头的结构都由PCR扩增引物A或B的序列标签酶识别位点锚定酶识别位点三部分组成。标签酶（Tagging Enzyme, TE）是一种IIS类限制性内切酶，如BsmF I等，它在距识别位点下游约20个碱基的位置切割DNA双链。 3）连接产物以标签酶酶切后用Klenow酶补平5突出端，得到两组分别带有接头A、B的短cDNA片段（约50个碱基）。混合并连接两组短cDNA片段，形成一个约100个碱基的双标签体（ditag）群，并以引物A和B对其进PCR扩增。 4）用锚定酶切割扩增产物，分离纯化去除接头后的双标签体（约26个碱基），并使之相互连接成为大片段的连接体，克隆至质粒载体内形成一个SAGE文库以备集中测序。 5）对测序得到的标签数据进行分析处理。在所测得序列中的每个双标签体之间由锚定酶序列相间隔，一般一个测序反应的结果可得到约20个双标签体，亦即包含了约40个转录本的信息。由于双标签体的长度基本相同，不会产生PCR扩增的偏态性；同时数量和种类极大的转录本群体使得由同两个标签重复连接成双标签体的可能性极小，因此通过计算机软件的分析统计能够相当精确地得到上千种基因表达产物的标签序列及其丰裕度。 对于在已知的数据库中找不到相同序列的标签，还可以利用约13个碱基的寡核苷酸探针（锚定酶识别位点＋标签序列）对cDNA文库进行筛选，以寻找新基因。SAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异（可精确到每个细胞中大约有多少拷贝），可建立较全面的基因表达谱，系统地分析基因表达的差异。 基因是生物制药事业的源头，生长点和制高点，源于基因的技术拓展将是21世纪制药企业开发新品的基础，基因研究现在成为全球瞩目的焦点。