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中国临床药理学杂志.1999,15(4):288-291 复方丹参滴丸对大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响 赵明中 汪家瑞 魏嘉平 高承梅 张宇洋 (首都医科大学宣武医院心内科 病理科 北京,100053) 摘要 为了探讨复方丹参滴丸对大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响。采用左冠状动脉穿线结扎法制备心肌缺血再灌注模型，分别以缺口末端标记法(TUNEL)及S—P免疫组化法检测心肌凋亡细胞、心肌细胞Fas、Bcl-2基因的蛋白表达的变化。结果表明，与假手术组比较，缺血再灌注组心肌细胞凋亡指数(AI)及Fas与Bcl-2蛋白的阳性表达指数(PEI)明显增加〔AI(%)：19.82±8.67比0.36±0.05；Fas PEI(%)：17.44±6.08比0.2l±0.03；Bcl-2PEI(%)：6.79±1.84比0.24±0.03，(P均0.01)；与缺血再灌注组比较，复方丹参滴丸干预后AI与Fas蛋白的PEI下降，且随复方丹参滴丸剂量加大而进一步降低(P0.05；P0.01)，大剂量复方丹参滴丸干预可轻度上调Bcl-2基因的蛋白表达(P0.05)。结论为复方丹参滴丸可通过抑制缺血再灌注后心肌细胞凋亡、下调Fas基因的蛋白表达与上调Bcl—2基因的蛋白表达以保护缺血再灌注心肌损伤。 关键词 心肌缺血再灌注损伤；基因表达；复方丹参滴丸 心肌细胞死亡是心肌缺血再灌注中最为严重的损伤形式，近来研究显示除有细胞坏死外，尚有部分心肌细胞凋亡[1]。细胞凋亡的发生受多种基因表达的调控。在哺乳类细胞，凋亡刺激基因Fas与凋亡抑制基因Bcl-2被认为与细胞凋亡关系密切[2，3]，丹参研究证明其有广泛的抗凝血、抗氧化、钙拮抗、保护缺血缺氧性心肌细胞的作用，但其对心肌缺血与 再灌注后心肌细胞凋亡及其凋亡相关基因Fas、Bcl-2的蛋白表达有何影响，迄今尚未见文献报道，本研究对此作初步探讨。 材料与方法 1．动物模型 雄性Wistar大鼠，体重260±35g，心肌缺血再灌注模型参照文献[4]方法进行，以穿线结扎左冠状动脉〔简称冠脉)致心肌缺血，拉松结扎线致心肌再灌注；仅穿线而未结扎者为假手术模型。 2．实验分组 42只大鼠随机分成四组：①假手术组：每天生理盐水灌胃1m1，共5d，末次灌胃l h后行假手术7h；③心肌缺血再灌注组：灌胃(方法同上)后行结扎左冠脉1h，再灌注6h；③复方丹参滴丸〔Dan Shen pills，DSP)干预I组：复方丹参滴丸以300mg·kg－1d－1溶于1m1生理盐水中灌胃〔方法同上)，末次灌胃1h后行结扎左冠脉1h，再灌注6h；④复方丹参滴丸干预Ⅱ组：复方丹参滴丸剂量为450 mg·kg－1d－1，余方法同复方丹参滴丸干预I组； 复方丹参滴丸由天津天使力集团制药有限公司提供。 3．心肌组织切片制备 实验结束前自大鼠左室活体灌注含肝素的生理盐水后，再灌注4％多聚甲醛以预固定心脏，取出心脏标本后继续固定24h(4℃)常规石蜡包埋，于心肌梗死区中部沿左室轴线每隔1mm连续切取数张5μm厚的切片，分别作HE染色、细胞凋亡及Fas与Bcl-2基因的蛋白表达检测。 4．检测指标 4．1 心肌细胞凋亡的原位标记检测 每一标本取3个不同部位的切片各2张，按末端脱氧核苦酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling，TUNEI)标记凋亡细胞核DNA3’—OH末端[5]。主要操作步骤为：切片脱蜡入水后蛋白酶K(20μg?ml-1)消化15min；新配制的1％H2O2甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶(POD)，加入20μl TUNEI混合液(含TdT酶及fluorescein-dUTP)，湿盒37℃孵育1h，PBS液漂洗；加POD转换液，37℃孵育30min，PBS液漂洗；DAB显色，苏木素复染。上述步骤中不加TdT酶者为阴性对照；正常心肌组织以DNase I(10μg?ml-1)消化诱导DNA链断裂，然后重复TUNEI法染色者为阳性对照，棕色核者为凋亡细胞。凋亡检测试剂盒购自德国宝灵曼公司。 4．2 Fas与BcI-2基因的蛋白表达检测 按S-P法行免疫组化检测。简要步骤为：切片脱蜡入水，经1%H2O2封闭内源性POD，修复抗原，以山羊血清工作液封闭切片，然后分别加入Fas与Bcl-2蛋白的抗体(Santa Cruz)、生物素化二抗、辣根酶标记链霉卵白素；AEC显色、苏木素复染。胞膜或胞浆着红色者为阳性表达细胞。 5．计算机图像分析 将TUNEI与S-P免疫组化切