丝素蛋白-壳聚糖三维多孔支架材料生物相容性及促成骨性能研究.pdfVIP

广东牙病防治 2013年2月 第21卷 第2期 容性及成骨性能。 1．3．4 细胞接种 将准备好的对照组和实验组支 架放入培养液浸泡24h，充分预湿，将其置于24孔 1 材料和方法 板内。取调整好浓度的细胞悬液 (除计算粘附率的 1．1 主要材料和试剂 细胞浓度为 1X10。／~／mL外，其余均为 5X 丝素蛋白粉 (湖州新天丝生物技术有限公司)， 10 爪／mL)100 滴加在材料上，震荡 5min。将 平均粒径2 m；壳聚糖 (上海伯奥生物科技有限公 3组均置于同一培养箱培养 1h后，沿孔壁边缘分别 司)，脱 乙酰度大于 90％；N一羟基琥珀酰亚胺 (N— 加入培养基200tLL，以刚浸没各支架材料为好，置于 hydroxysuccinimide，NHS)(Sigma公司，美 国)，碳化 培养箱中培养。 二亚胺 [1一ethyl-3-(3-dimethylaminopropy1)carbodiim— 1．4 细胞粘附率测定 ide，EDC](Sigma，美国)，CellTiter96@MTS[3-(4，5- 于培养 1、3、6h后分别测定 3组细胞粘附率， dimethyhhiazol-2-y1)-5(3-carboxymethoxypheny1)-2- 每组每次取3孔，吸出培养基，计算培养液中的细胞 (4-suffopheny)．2H—tetrazolium，innersalt]细胞增殖检 数 目(A1)，取出材料后，对该孔贴孔壁细胞消化，计 测试剂盒(Promage公司，美国)，硝基苯磷酸盐片剂 数为(A2)。按以下公式计算粘附率：细胞粘附率= (Sigma公司，美国)。 [(A0一A1一A2)／AO]X100％(其中A0为接种细胞 1．2 主要仪 器 数)，将 以上每组3孔的平均值记为粘附率。 冷冻干燥机 (VIRTIS公司，美国)，二氧化碳培 1．5 Hoechst染色 养孵育箱 (GMBH公司，德国)，IXS1倒置显微镜及 培养3h、6h、12h、1d、2d、3d后取出各组 照相系统(OLYMPUS，日本)，超净工作台，680酶标 材料，磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS) 仪(BIO—RED公司，美国)。 漂洗，加入体积分数4％多聚甲醛固定 10min，PBS 1．3 样品制备及分组 漂洗，滴加 10 g／mL的Hoechst液体300 L，于室 1．3．1 样品制备 溶液配制：称取5g丝素蛋 白粉 温孵育30min，PBS冲洗，滤纸吸去表面残留PBS液 于 80℃溶解于氯化钙 3元溶解体系，摩尔 比为 体，立即在荧光显微镜下观察。 CaC12：C2H5OH：H2O=1：2：8 ，透析 3d，浓缩，离 1．6 细胞增殖率检测 心，得到质量分数为2％的丝素蛋白溶液。将3g壳 培养 1d、3d、5d后取 出材料，用 PBS漂洗 聚糖溶于 100g的0．2mol／L乙酸溶液制得质量分 2遍，移人新 24孔板，每孔 1块，加入新鲜培养基 数为3％壳聚糖溶液。 300；xL后避光加人MTS60p．L，在 37℃恒温箱孵育 丝素蛋白一壳聚糖支架材料的制备 ：以2％丝 3h后，吸取培养基液体，置于酶标仪内，在波长 素蛋白与3％壳聚糖相混合，使丝素蛋 白溶液和壳聚 490nm处测量各孔光密度(opticaldensity，OD)值。 糖溶液的质量分数分别为40％、60％，作为实验组； 1．7 碱性磷酸酶活性测定 对照组只