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在海洋、湖泊、河流、池塘和饮用水中微生物都混杂地生长或生存着,要研究某一微生物,必须把它从混杂的微生物类群中分离出来,这种过程称为“分离”。微生物学中把一个细胞通过分裂得到后代的过程叫做纯化培养。微生物分离与纯化的方法很多,可分为稀释倒平板(平皿)法,划线法单细胞挑取分离法和培养条件控制法等。后者包括.选择培养基分离法。好氧与厌氧培养分离法和pH 、温度等控制分离法。
??? 应用上述方法使细菌单个细胞或同一类细胞在培养基上长出菌落,而后根据菌落及菌体的形态特征挑取所需单个菌落的菌苔少许,接种于斜面培养基中培养,然后再从斜面培养基的菌苔挑出分离(或直接从单菌落中挑出),反复数次直到生长的菌落形态一致及其菌体形态也一致为止,则可提供生理生化鉴定、研究。一、培养基的配制?
(一)培养基配制的基本原理
????? 由于科学研究或生产需要,人工配制的适合于不同微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质及其生活环境叫培养基.各种微生物对营养的要求各不相同。尽管当前培养基配方多至数千种,但为进一步研究微生物和提高生产,特别是寻找或发现新种时,现有培养基配方不一定是最适用的,甚至是不适用的。譬如:目前尚未找出一种培养基能满足海泥或海水样品中所有的微生物生长的需要。因此,在学会配制培养基的同时应掌握关于培养基配方设计的基本原则。1 .选择适宜的营养物质?
( 1 )碳源:它是构成微生物细胞及其代谢产物碳架的营养基质和提供能量的来源。碳源可分为有机和无机两大类。培养自养微生物时、一般挑选无机碳化合物作为碳源,而培养异养微生物时则用有机碳,即碳水化合物,碳氢化合物等。
( 2 )氮源:它是构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的基本营养物质,也可分为无机和有机氮源两大类。主要是作为微生物细胞合成原生质和细胞其他结构的原料。一般不作能量的提供者。培养有固氮能力的固氮细菌,部分光合细菌和蓝藻用分子氮.即气态氮(空气),培养酵母菌、霉菌,放线菌和许多腐生细菌及动植物的病原菌.多选用铵盐或硝酸盐作氮源,也可利用某些有机氮化合物为氮源。如蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、鱼粉、黄豆饼粉、玉米浆等。( 3 )无机盐:其主要功能是构成细胞和酶组成部分,维持酶的活性.调节微生物细胞的渗透压,氢离子浓度,氧化还原电位等,配制一般微生物培养基时采用硫酸盐、磷酸盐和含钾,钠、镁、铁、氮等元素的化合物.培养硫细菌时,应适当增加硫的用量。培养海洋微生物时,则要增加氯化钠含量,或以陈海水代替蒸馏水等。( 4 )微量元素:如钼、锌、锰、钴、镍、铜、碘、溴、钒等。主要功能是作为酶蛋白成分之一,能活化酶。它们的存在与否,往往能非常强烈地影响微生物的生命活动。微生物对其需要量极微,在培养基中一般仅含0.1ppm就能满足,多了反而会使微生物中毒。这些微量元素常常混在其他营养物质和水中,所以配制培养基时,通常不需另加效量元素。( 5 )生长素:包括维生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶三类物质,是维持微生物正常生活不可缺少的、需要量不大的特殊有机物。大多数维生素是辅酶的组成结构,嘌呤和嘧啶的主要功能是构成核酸和辅酶.很多异养微生物和所有自养微生物本身都能合成所需的生长素,均不必在其培养其中另加现成的生长素。缺陷型的变异菌株则需要在基本培养基中附加适量相应的生长素才能生长得好。常用作生长素的物质有酵母膏、玉米浆、肝浸液等。许多作为碳、氮源的天然成分,如麦芽汁,土豆汁,牛肉膏、麸皮、米糠等皆含有丰富的生长素,在含有此类物质的培养基中就无需加生长素。( 6 )水:微生物细胞内含有大量的水分(约75-85%), 它既直接参加微生物的代谢过程,又是代谢反应的介质。水的比热高,有利于调节微生物细胞的温度。所以水在微生物细胞中的功能是多方面的。海水、自来水,河水等均可用于培养基的配制,但当水中的矿物质含量过多时必须经过软化后才能采用.配制合成培养基时应采用蒸馏水或无离子水。培养海洋微生物或其稀释液时需用陈海水。
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( 7 )凝固剂:有琼脂(洋菜)、明胶(动物胶)及硅胶(水玻璃)等。制备固体或半固体培养基时皆需加入上述凝固剂中的一种。琼脂性能稳定不被大多数微生物液化、分解、利用.对大多数微生物无害,不因灭菌而受破坏,40 ℃ 时凝固,96 ℃ 能完全熔化,透明度、粘度皆好,故制平板、斜面或半固体培养基时均使用它。而明胶的熔点低(25 ℃ ), 能被多种微生物水解利用,故仅在鉴定微生物时使用它。硅胶与盐酸及硫酸中和时凝成胶体,适用于分离自养微生物如硝化细菌,亚硝化细菌等。
2.确定各种营养物质的用量
在设计配制培养基方案中除选择各种营养物质外,还必须确定所需营养物质的用量及其量的比例。这应根据所培养的微生物在整个代谢过程中的需要和培养目的而定,以适量为宜,既不妨碍微生物正常生长和培养的目的,又不致于造成浪费。培养基中水溶性
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