牛蛙皮肤cDNA文库的构建和鉴定.pdfVIP

638 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 牛蛙皮肤cDNA文库的构建与鉴定 赵瑞利1，韩俊友1，雷连成1，乔红伟2，李莲瑞1，胡博1，谢芳1，刘丽凡1，韩文瑜‘ (1吉林大学和平校区，长春130062：2中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所，北京100021) 摘要：牛蛙皮肤组织为材料获得总RNA，用偶联有Olido(dT)的磁珠纯化mRNA后，利用含蹄I酶切位点的 LD．PCR合成双链eDNA，双链eDNA经匈R I酶切，通过T4DNA连接酶连接到经过相同酶切Ig／kTdplEx2载体，体 coli 外包装后转染E XLI-Blue宿主苗，进行滴度测试和文库扩增。结果构建的牛蛙皮肤eDNA文库原始库客 量为1．42x106 pfu／mL，插入片段长度在0．5～1．5kb，重组率为89．5％，扩增后的文库滴度为1．35x109 pfu／mL， 构建的文库质量符合要求，可用于大规模的功能基因分析。 关键词：DNA文库；牛蛙：抗菌肽 、 两栖动物皮肤(无尾两栖动物)在自然进化过程中形成了防御病原微生物的三套防御系统．相应地 具有特定结构。皮肤抗菌肽是其中先天性防御系统的主要组成部分。两栖动物皮肤抗菌肽具有高效、 广谱、不易产生耐药性等特点9。J，并且两栖类皮肤抗菌多肽还具有结构多样性，表现在：单个种类 甚至单个个体的两栖动物皮肤中都含有大量结构不同的抗菌多肽。 在国外”】，从蛙皮中提取的抗菌肽正应用于治疗人皮肤感染的临床试验。因为有些蛙皮肽杀死各种 癌细胞的浓度比杀死正常细胞的需要量低10倍，所以它可能成为潜在的抗癌试剂。其中，牛蛙皮肤具有 独特和天然的免疫能力，在牛蛙皮肤中发现的抗菌肽能够杀灭导致失明的假单胞细菌和消除其它炎症 的细菌，比常用抗生素的效力还高，缓解了细菌对常用抗生素的耐药性问题。 但由于抗菌肽分子量小，分离提取存在一定困难，天然资源有限，通过生物合成技术提高产量则 成本较高“』，现在已经发展了重组DNA技术来获得大量的蛙皮抗菌肽。因为cDNA文库包含了特定 组织在某一时期表达的完整nlRNA信息，是克隆相关基因并研究其生物学特性的基础。为此，我们以 XTfipIEx2为载体构建了牛蛙皮肤cDNA文库，为进一步研究牛蛙皮肤组织抗菌肽奠定基础。 1材料与方法 1．1材料 牛蛙(rand catesbeiana)，购自湘潭市水产研究所。SmartrucDNA文库构建试剂盒及宿主菌Ec础 Calculater(Gene QuantPro)jt,京安玛西亚公司． 1．2方法 1．2．1 RNA的提取与mRNA的分离 采用TRIZOL 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 作者简介： 赵瑞利(1979．)．女(汉族)，河北省石家庄市，博士，主要从事分子免疫与病原微生物学研究。 E-mail：zhaoruilill09@126．tom 通讯作者： 韩文瑜(1955·)，男，教授，博士生导师E-mail：hanwy@jlu．edu．cn 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 639 5min。旋涡15s混匀，4C，120009，离一0,10min-弃上清，加入lml RNase．free 离心5mill，重复一次。超净工作台中干燥90S，用30m water溶解，即得到牛蛙皮肤组织总RNA． 经1．2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，测定A260和A2∞，分析RNA的浓度和纯度。 采用磁珠法纯化mRNA，操作步骤按照QIAGEN公司提供的试剂盒说明书进行。 1．2．2 eDNA第一链的合成 以0．25399 SMARTIV eDNA第一链。反应体系为lo山：10a mM 冰浴2 5*Fir