影像体外分析.ppt

* 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属—镧系元素 镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种：钐(Sm)，铕(Eu)，镝(Dy)，鋱(Te) 镧系元素荧光重要特点： 1. 极长的荧光衰退时间 铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质：10ns 2. 200nm的Stokes位移 铕：激发光340nm，发射光613nm 荧光素的Stokes位移为273nm 3. 狭窄的发射峰 4. 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 * 时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay） 一、基本原理 镧系元素（15）：铕（Eu），钐（Sm），镝（Dy），鋱（Te） Eu + Eu Eu + 增强液 + Eu “解离增强镧系荧光免疫分析” * 时间分辨荧光检测的基本原理示意图 荧光衰退时间 铕：730000 ns 钐：50000 ns 一般荧光物质：10 ns 铕的荧光 * （二）TrFIA的特点 1. 最大限度提高测量方法的灵敏度 2. 有与RIA相似的特异性和精密度 3. 可同时测定两种以上的抗原 4. 无辐射污染 * DELFIA技术的特点为临床检测带来的先进性 技术 特点 检验先进性 时间分辨 将特异性荧光与 零背景 波长分辨 非特异性荧光分离开 高特异性 解离-增强 荧光性大大提高 线性范围更宽 稳定的荧光螯合物 重复性更好 低分子量 标记位点多可达20个 灵敏度更高 原子标记 对标记物的结构与活 高稳定性，高精确度 性影响小 无衰变 试剂保质期至少一年 受环境影响小 标准曲线保留时间长/ 同一批次只需两点定标 多标记 单，双，三，四标记 一个试剂盒可同时测多个项目 * 体外分析的发展 方法设计的改变：竞争结合分析 非竞争结合分析 标记物的改变：放射性核素 荧光、酶、化学发光、稀土元素 结合体的改变 * * 反应速度快、灵敏度高、特异性强、稳定性好。 缺点：目前还主要限于蛋白质和多肽抗原，很多小分子半抗原和短肽还不能应用 * 4. 特异性： 方法的特异性主要取决于抗体的特异性。 用抗体的交叉反应率来表示。 5. 稳定性： 测量结果的稳定性可以通过剂量反应曲线的各个参数的稳定性来间接反映。 如标准曲线的斜率和截距，零标准管结合率的75%、50%、25%处的剂量值(ED75、ED50、ED25等)。 * 五、RIA的方法学 （一）反应方式： 1. 平衡加样法：也称一步法，是将非标记抗原、标记抗原和抗体同时加入反应体系进行反应。 优点：使非标记抗原、标记抗原两者与抗体有相同的反应几率，操作方便，精密度较好，稳定性好。 缺点：反应时间长，灵敏度较差。 * 2. 顺序加样法：先将非标记抗原与抗体温育反应一定时间（6～24小时），形成抗原抗体复合物后，然后再加入标记抗原短时间（1～4小时）温育后中止反应。 优点：使非标记抗原与抗体结合的几率比标记抗原高，提高了非标记抗原的竞争能力，提高了方法的灵敏度。 * （二）反应介质： 1. 缓冲液：(pH值：7.4～7.8) 缓冲液为RIA提供一个适合的反应环境，是RIA成败的关键。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液，Tris-HCL缓冲液等。 2. 离子强度：0.05～0.1mol/l 离子强度过高会抑制抗原抗体反应，过低会降低缓冲能力，引起反应系统PH值的变化，同样会影响抗原抗体反应。 * 3. 添加剂： 0.5％牛血清白蛋白：减少反应试管对微量抗原、抗体的吸附。 0.01