第三章PCR技术及其应用.ppt

核酸扩增技术 第一节 聚合酶链式反应 PCR 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction) 一、PCR的反应过程 1.在体外如何使模板DNA的双链解开，提供单链做为模板呢？ 2.在体外如何使引物与模板结合，以催化新的子链的不断延伸？ 添加剂 加入适量二甲基亚砜或甲酰胺 破坏模板的二级结构，利于解链。 加入BSA或DTT 增加或改进DNA聚合酶的稳定性。 Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 三、PCR的反应条件 平台出现的迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早 平台效应产生的因素： 反应体系各组分的消耗 引物二聚体的产生 引物和已扩增的DNA片段间的竞争等 第二节 以PCR为基础的相关技术 逆转录合成cDNA所用的引物： 以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物 以oligo(dT)作为引物 以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引物 （一）引入点突变 （二）引入片段性缺失 原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水平和细胞水平研究并重。 第三节 定量PCR 相对定量PCR的优势与不足 不需要特殊的检测设备和试剂即可以对靶基因进行相对定量。 内对照系统无法排除参照基因本身表达变化的影响及参照基因和靶基因两者扩增效率不同等因素对实验结果的干扰。 必需确定反应不处于平台期。 劳动强度大，定量不准确 （一）荧光信号的检测方法 （1）定量PCR的外参照系统 1. 制备标准品并计算标准品浓度 2. 将标准品做10倍的倍比稀释 3. 系列稀释的标准品与样本同时检测 4. 绘制标准曲线并依据样品的Ct值 计算样品拷贝数。 优点：避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异 缺点：仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩增效率 第三章 PCR技术及其应用 A：何谓RT-PCR，三种RT引物各有何特点？ B：何谓巢式PCR，请举一例说明其在临床诊断 中的应用？ C：何谓多重PCR，请举一例说明其在临床诊断 中的应用？ D：何谓原位PCR，与原位杂交有何异同？ E：试设计用实时定量PCR检测HBV DNA的大致方案。 F：试设计用实时定量PCR检测基因的差异表达的大致 方案。 第四节 PCR产物分析 一、PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。 应用： 1 2 3 4 5 6 7 8 HbA: N’ Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys HbS: N’ Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys HbA基因: －－－－－－ CCT GAG GAG － HbS基因: －－－－－－ CCT GTG GAG － 二、ASO技术 受检者基因组 DNA 或含 突变位点的PCR扩增产物 与标记的 ASO 探针杂交 二、ASO技术 镰状细胞贫血： GAG(Glu)--GTG(Val)? bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC bS probe ACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC? 二、ASO技术 Reverse Dot Hybridization，RDH 如果同一种疾病有多种突变类型，则可将相应于各种突变的不同ASO探针点膜，然后与标记的受检DNA杂交，称为反向斑点印迹杂交? probe 1 2 3 4? 四、熔点曲线分析 基于SYBR Green I 的荧光信号检测 第五节 临床基因扩增检验的质量管理 一、实验室设置 1.实验室的规范化设置 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 1. PCR技术的质量保证 分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理