第二部分体外培养细胞生长条件及细胞培养的基本设备条件及使用原则.ppt

第三章 体外培养细胞生长的条件 1、细胞的生存环境和条件 2、用于培养的基础液体 3、培养液 培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。 主要包括培养基、平衡盐溶液、常用试剂三大类。 水不仅是细胞的主要成分，也是细胞赖以生存 的主要环境，营养物质、代谢产物都必须溶解在 水中，才能被细胞吸收和排泄。 体外培养细胞对水的质量非常敏感，要求很高。 水的纯度不够,即使有害元素含量极少对细胞也会 产生不利的影响，有时引起细胞中毒死亡。 去离子水装置 此装置内有离子交换树脂,应用离子交换树脂去除水 中的阴离子和阳离子 ，但不能去除非离子物质或有 机物质，因此组织培养中很少使用。 在离散细胞或培养细胞过程中，试液中加入适量抗生素，可预防操作不慎而产生的污染。常用的有青霉素、链霉素等。常分装小瓶，冷冻保存。使用前加入到培养液内，每小瓶最好一次用完。 第一节 实验室的设置 1、设计原则 2、无菌操作区 3、培养区 4、制备区 5、储藏区 6、清洗区和消毒灭菌区 无菌操作室： 更衣间：更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩 缓冲间：保证操作间的无菌环境，同时可放 置恒温培养箱及小型离心机等 操作间：专用于无菌操作、细胞培养。大小 适当，顶部不宜过高，墙壁光滑无 死角。 1、基本设备 2、普通器材 3、特殊设备 玻璃瓶皿：玻璃瓶、培养瓶、培养 皿、吸管、离心管等 塑料瓶皿：多孔培养板、培养皿、培 养瓶等 流式细胞仪 荧光显微镜 电泳仪 冰冻切片机 酶联免疫检测仪 激光共聚焦细胞仪 第三节 设备使用一般原则 1、无菌室的使用和消毒 2、实验人员的无菌准备 3、培养器械的清洗和消毒 清 洗 1、玻璃仪器的清洗 2、橡胶制品的清洗 3、塑料器皿的清洗 清洗消毒示意图 包 装 目的：防止消毒灭菌后再次遭受污染。 材料：包装纸、牛皮纸、铝箔纸、棉布、 不锈钢或铝制饭盒等 消 毒 （一）物理法： 1、干热消毒 2、湿热消毒 3、紫外线消毒 4、滤过灭菌 记数板计数示意图 记数板正面观 16个小方格 细胞悬液的细胞数/ml=（四大格子细胞数/4）×2×104 说明：/4因为所记述了4大格的细胞数； × 2因细胞悬液：染液=1:1稀释； × 104因为计数板中每大格的体积为：1.0mm*1.0mm*0.1mm =0.1mm3而1ml=1000mm 3 特殊设备 流式细胞仪 将待测细胞染色后制成单细胞悬液，流式细胞仪常以激光作为发光源，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。通过测量散射光和标记荧光强度，快速分析细胞的物理或化学性质，并对细胞进行分类收集，进行定量或定性分析。 荧光显微镜 以紫外线为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光，在强烈对衬背景下，即使荧光很弱也易辨认，敏感性高。 电泳仪 根据带电粒子、不同物质所带电荷及分子量的不同，在电场中的运动速度不同，对不同物质进行定性或定量分析 冰冻切片机 酶联免疫检测仪 酶标记抗体与吸附在固相载体上的抗原发生特异结合，在酶的作用下发生化学变化，表现出颜色反应。这种显色反应可经仪器进行定量测定。 激光共聚焦细胞仪 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30-40%，使用紫外线或可见激发荧光探针，得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察形态、膜电位等生理信号。 一、无菌室的灭菌 （1）定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地，擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或新洁尔灭或0.5%过氧乙酸擦拭。 （2）CO2培养箱灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75%酒精擦拭或0.5%过氧乙酸，再用紫外灯照射 （3）实验前灭菌：打开紫外灯、空气净化器系统等各20-30分钟 （4）实验后灭菌：用75%酒精（ 3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 2、实验人员的无菌准备： （1）肥皂洗手 （2）穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋 （3）用75%酒精棉球擦净双手 3、无菌操作的演示： （1）凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面。 （2）靠近酒精灯火焰操