第章免疫原和抗血清的制备.ppt

第一节 免疫原的制备 第二节 免疫佐剂 第三节 抗血清的制备 第四节 抗血清中抗体的纯化 第五节 抗血清的鉴定和保存 * 临床免疫学与免疫学检验 * 免疫动物前需将福氏佐剂与抗原充分混合成乳剂。乳化的方法有两种：一为研磨法，二为搅拌混合法。 ⑵细胞因子佐剂  * 临床免疫学与免疫学检验 * 二、作用机制1、改变抗原物理性状 2、刺激单核/巨噬细胞系统 3、刺激淋巴细胞增殖和分化 4、改变抗体类型以及诱导迟发型超敏反应 * 临床免疫学与免疫学检验 * 第三节 抗血清的制备 制备高质量的抗血清，除了掌握好抗原抗体的纯化外，还需选择适宜的动物和设计有效可行的免疫方案。 一、免疫动物的选择 主要有哺乳类和禽类。常用的有兔、绵羊、豚鼠和鸡，有时采用山羊和马。 * 临床免疫学与免疫学检验 * 选择因素 1、抗原来源与免疫动物种属的关系 差异越远越好，亲缘太近不易产生良好抗体，甚至完全不产生抗体（如兔大鼠之间，鸡鸭之间）。 2、动物个体的选择 健康（以雄性为佳） * 临床免疫学与免疫学检验 * 抗血清的要求：抗血清可分为R（rabbit）型与H（horse）型。 R型抗血清（R型抗体）是用抗原免疫家兔及其他小型动物所产生的抗体，该抗体具有较宽的抗原抗体比例范围，适于作诊断试剂。 H型抗血清（H型抗体）用抗原免疫马等大型动物所产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较窄，一般用于免疫治疗。 * 临床免疫学与免疫学检验 * 3、抗原的性质 不同性质的免疫原，适用的动物不同。蛋白质抗原大部分动物适合，在某些动物体内有类似物质或其他原因时，蛋白质抗原对这些动物免疫原性极差。（IgE对绵羊、胰岛素对家兔） 甾体激素免疫多用家兔，酶类免疫多用豚鼠。 * 临床免疫学与免疫学检验 * 二、免疫程序 1、免疫原的剂量 考虑因素：免疫原性的强弱、动物个体、免疫时间 剂量：过高、中间剂量、过低效果各异 半抗原：免疫时，载体应始终相同  * 临床免疫学与免疫学检验 * 2、免疫途径 静脉、腹腔、肌肉、皮内、皮下、淋巴结和足掌等，初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射，宝贵抗原淋巴结内微量注射。 3、免疫间隔时间 第二次与第一次一般以间隔10--20天为佳，第三次及以后的间隔一般为7--10天，不能太长。 * 临床免疫学与免疫学检验 * 三、动物采血法 动物免疫3-5次后，如血清效价不理想可追加免疫1-2次后再行放血。应选择在末次免疫后5-7天及时采血，取血前动物应禁食24h，以防血脂过高。 1、颈动脉放血法 2、心脏采血法 3、静脉多次采血法 分离血清：室温自然凝固，然后37℃或4 ℃使血块收缩后，收集血清。  * 临床免疫学与免疫学检验 * 第四节 抗血清中抗体的纯化 是免疫测定和标记免疫技术的一个重要基础，最常用的纯化方式是特异性抗体的纯化、IgG类抗体的纯化。 一、特异性抗体的纯化 去除杂抗体 1、亲和层析 交叉杂抗原交联到Sepharose4B  2、吸附法 利用不含特异性抗原的抗原液制成固相吸附剂。  * 临床免疫学与免疫学检验 * 二、IgG类抗体的纯化 在免疫标记技术和其他技术中，均采用IgG类抗体。 ㈠盐析法 硫酸铵盐析法或20％硫酸纳沉淀γ球蛋白 ㈡离子交换层析法 PH7.5时QAE-sephadex带正电荷， IgG也带正电荷不能被吸附。 ㈢亲和层析法 纯化抗原（讨论！）或SPA交联Sepharose4B 制成亲和层析柱。 * 临床免疫学与免疫学检验 * 第五节 抗血清的鉴定和保存 在收获血清前，应用标准抗原进行初步鉴定及测定其效价，动物采血后应及早分离出血清。 一、抗血清的鉴定 1、抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法 2、抗体效价的鉴定：一般原则是可溶性抗原用沉淀反应、ELISA，颗粒性抗原用凝集反应。  * 临床免疫学与免疫学检验 * 表抗血清效价测定 * 临床免疫学与免疫学检验 * 3、抗体的纯度鉴定：可用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），区带电泳 4、抗体亲和力的鉴定： * 临床免疫学与免疫学检验 *  二