组织培养基本技术（一）(二）.pptVIP

六、细胞的冻存与复苏 一、培养室内的无菌操作 二、培养细胞的取材 三、组织材料的分离 四、接种 （一）培养前准备 （二）培养室和超净台的消毒 （三）操作者的消毒 （四）无菌培养操作 培养室和超净台的消毒 1、无菌室的消毒： 0.2％新洁尔灭或 2％～5％来苏儿 2、超净台的消毒： 75％酒精擦洗台面 注意：1、培养用液和培养细胞不宜照紫外线 2、消毒时台面上的用品不宜过多或重叠放置 操作者的消毒 1、进入无菌室前：彻底洗手并按要求着装 （无菌服、帽子、口罩） 无菌培养操作 1、近火焰操作 2、手的操作 无菌工作台操作布局示意图 二、体外培养的一般过程 体外细胞培养一般过程： 组织获得→ 组织消化→ 接种→培养→传代 及细胞冻存复苏等 材料来源 取材的基本要求 材料来源： 一般： 一切有生命活动的组织 最好： 胚胎组织、低分化组织、 幼体组织、肿瘤组织 取材的基本要求： 1、取材的组织最好尽快培养 2、严格无菌操作 3、用锋利的器械切碎组织 4、为避免组织干燥，可在修剪和切碎过程中 加入少量培养液 5、正常细胞的原代培养应采用营养丰富的 培养液 （二）组织细胞的分离 离心分离法：体腔液、血液和羊水 机械分离法 消化分离法 1、原代培养分为两种： 1） 组织块培养法 2） 组织消化培养（单层培养法）：适用于 细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、 上皮及传代细胞等。 一般而言幼体组织比老龄组织，分化低的比分 化高，肿瘤组织比正常组织易于培养。 （三）接种 1、培养瓶的准备：数量若干,附着物,标签 2、接种密度：（1~6）×105/ml （四）传代培养 传代: 细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养 瓶的过程称之为传代。 首次传代的注意点： 1、细胞生长至90％以上覆盖瓶底方可传代； 2、对胰蛋白酶的不同耐受时间分离所需细胞； 3、吹打细胞时动作轻巧，以减少对细胞的损伤； 传代细胞生长状况 (G15 ,接种24h) 传代细胞生长状况 (G17 ,培养3d) （五）细胞的冻存复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。 1、冻存意义： 1）长期保存细胞； 2）防止细胞老化； 3）减少人力、经费，减少污染。 细胞的冻存 细胞的复苏 常用低温保护剂： 作用：在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大 提高冻存效果。 常用的低温保护剂—— 1、 DMSO（二甲基亚砜）：一种渗透性 保护剂，能够降低细胞冰点，细胞内水分渗出， 减少冰晶的形成 2、 甘油：提高细胞膜对水的通透性 细胞冻存（缓慢） （一）慢冻程序 （二）低温保护剂 （三）冻存步骤 慢冻程序： 冻存步骤： 对数生长期细胞 胰蛋白酶液消化细胞 离心 加冻存液（10%DMSO或甘油、10- 20%小牛血清） 入冻存管（1-1.5ml），密封 标记 液氮罐冻存 细胞复苏（快速）：以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害 （l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入 37℃ 水浴中，并不时摇动使其尽快融化； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速1000rpm，离心5分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞， 计数、调整细胞密度，接种培养瓶。 过程 组织取材 组织细胞的分离 机械法 消化法 机械法分离胚胎 组织块培养法 培养瓶翻回，置于37℃培养 基本步骤：无菌取出目的组织 ↓ 用利刀无菌切割成1～2mm小块 ↓以Hanks液漂洗干净,低速离心，弃上清 ↓ 培养瓶翻转1800，置15～30分，使其贴壁 ↓ 移入培养瓶，加入适当培养基浸润 组织块培养示意图 1-2mm3 2h 细胞从组织块游出 将组织块按照一定间距转入培养瓶内4、静置30分钟（使组织块更好