级五年制实验课酶联免疫吸附试验.pptVIP

2013级五年制本科生免疫学实验课 李冬 基础医学院免疫学系 lidong1@jlu.edu.cn 酶联免疫吸附试验 (ELISA直接法) 实验内容 一、酶联免疫吸附试验(ELISA) 直接法-测酶标抗体的效价 二、免疫标记技术的基本原理、类型 及应用 实验目的 掌握ELISA直接法的操作过程。 掌握免疫标记技术的分类、原理及应用。 实验原理示意图 包被抗原 实验材料 试剂： 封闭液 6ml 洗液(PBS-Tween20) 1瓶 样品稀释液(PBS) 4.5ml 兔血清 (已包被) 酶标抗体(HRP-Ab) 1.5ml 底物 4.5ml 终止液(H2SO4) 2ml 器材： 酶标板(已包被) 1块 锡 纸 1张 200?l pipette 1把 Tip 若干 试管 7支 1ml吸管(配胶帽) 1支 培养箱43℃ 1台/室 吸水纸 若干 记号笔 1支 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(正常兔血清)稀释至蛋白质含量为10?g／ml。100 ?l/well加入聚苯乙烯板酶标板中，4℃ over night。次日，弃去孔内溶液。 封闭：150 ?l/well封闭液, 43℃ 40min，弃去封闭液。 加样：加倍比稀释的酶标抗体 (羊抗兔IgG)，100?l/well 分别加到对应的板孔内，置43℃孵育40mins。洗板三次，每次3分钟。稀释方法与加板方法见后 加底物液显色：于各反应孔中加入新鲜配制的OPD底物溶液100 ?l/well，室温下避光显色。 终止反应：加50 ?l/well　2N 硫酸(终止液)。(改变PH值) 结果判定：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的酶标抗体的稀释度为该抗体的效价。 实验步骤 抗体稀释及加样方法 500?l 样品稀释液 女 女 500?l E-Ab 第8列：阴性对照（Ag+/Ab-）第9列：阴性对照（Ag-/Ab+） 第10列：空白对照（Ag-/Ab-） 1.准备6个稀释管，做好标记。 2.先在每个稀释管中加入稀释液500ul。 3.取500ul抗体加入第一管，混匀后，取出500ul加入第二管，依此类推至最后管。 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ PBS 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:1 抗体起始浓度 1:1000 包被 固相支持物： 聚苯乙烯和聚氯乙烯有较强的非特异性物理吸附蛋白质的特性，被吸附的蛋白质的免疫学活性不发生改变（Ag-Ab结合） 包被缓冲液： 碳酸盐缓冲液（pH＝9.6） 磷酸盐缓冲液（pH＝7.2） Tris-HCL缓冲液（pH＝7-8） 包被温度、时间： 4℃ 　18-24小时 包被抗原浓度： 10ug/ml 封闭的作用 包被时所用的抗原或抗体浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止非特异性吸附，影响结果的准确性。如图： Coating Blocking 封 闭 的 作 用 E E E After blocking After blocking E E E Without blocking E E 最常用的封闭剂： 0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA） 10%的小牛血清 1%明胶 洗 液（PBS-T）　 磷酸盐缓冲液：（PBS） 吐温20（Tween 20): 非离子型表面活性剂 抑制蛋白质非特异性吸附于塑料表面 标记抗体常用的酶 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。　 显色原理 常用的供氢体： 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB ABTS DH2 + H2O2 HRP D + 2H2O （底物） OPD（邻苯二胺） OPD氧化后的产物呈明黄色，用酸终止酶反应后，由橙红色转向棕黄色，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配现用。 TMB（四甲基联苯胺） TMB经HRP作用后其产物显蓝色，目视对比鲜明。 TMB性质稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。 酶反应用HCL或H2SO4终止后，产物由蓝色变成黄