重组质粒的转化、筛选和鉴定.pdfVIP

中国试剂网 3.9.270 重组质粒的转化、筛选和鉴定 一、实验目的 1、学习克隆工作中最常用的双酶切； 2 、学习将外源基因与质粒连接方法及操作技术； 3、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的技术； 4 、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 5、外源质粒DNA 转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 6、学习鉴定重组子的方法。 二、 实验原理 重组子的建立：采用双酶切质粒载体pBR322 和pUC18 ，酶切后产生了互补的粘 性末端，在T4DNA 连接酶的作用下，两个质粒片段连接。 感受态细胞(Competentcells)：受体细胞经过一些特殊方法 （如：CaCl，RuCl 等 化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competentcell) 。 转化 （transformation ）：是将异源 DNA 分子引入一细胞株系，使受体细胞获 得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载 体DNA 分子导入受体细胞。 克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那 霉素、氯霉素、四环素、链霉素等； 重组质粒克隆的鉴定：鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α互补、小规模制 备质粒DNA 进行酶切分析、插入失活、PCR 以及杂交筛选的方法。最常用的方 法是小规模制备质粒DNA 进行酶切分析，对于带有LacZ 基因的载体还可以结 合α互补现象来筛选。 三、试剂与器材 1、试剂 pUC18 质粒，pBR322 质粒，DL2000Marker,PstI(15U/ul)及酶切缓冲液, EcoRI(15U/ul)及酶切缓冲液，DNALigationKitVer2.1(TaKaRa) ，LB 液体培养 基(LuriaBertani) ，LB 固体培养基，50mg/ml 卡那霉素(kanamycin)储存液，质粒 快速提取试剂盒 （博大泰克），10XBufferK， PstI ，EcoRI(TaKaRa) 中国试剂网 3.9.270 2 、器材 电基因转移议，恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝 胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪，超净工作台， 微量移液枪，eppendorf 管。 四、操作方法 1．构建重组质粒 质粒pUC18 和pBR322 分别用Pst I 和EcoR I 双酶切，将酶切产物按照1：1 的 比例混合，使用T4DNA 连接酶连接，构建成重组质粒。 2 ．制备感受态大肠杆菌细胞 收集大肠杆菌细胞，采用CaCl2 处理，制备成感受态细胞。 3 ．重组子的转化 将构建的重组质粒加入到制备的感受态细胞悬浮液中，电击法将重组质粒转化到 宿主细胞中。 4 ．重组子的筛选鉴定 采用蓝白筛选重组子。酚/氯仿快速抽提质粒，酶切后电泳鉴定。 五、关键步骤与注意事项 2 ．连接反应温度选择要适中，过高粘末端之间形成氢键不稳定，过低会影响连 接酶的活性。 3 ．连接反应两种质粒的比例为1：1，否则容易自连。 4 ．制备感受态细胞时要采用对数生长期初期的细胞，低温处理时间要足够。 5 ．电击法时电击电压、电流、时间选择要合适。 6 ．转化及蓝白筛选要作阴、阳性对照，防止出现假阳性、假阴性。