利用红色荧光蛋白分析里氏木霉合成纤维素酶机理.pdfVIP

47卷 l期 微 生 物 学 报 47(1)：69～74 2007年2月4日 4 2007 Ac缸Micmbio酗gic口s主nic口 Febmary 利用红色荧光蛋白分析里氏木霉合成纤维素酶的机理 刘 刚，张 燕，李 云，余少文，邢 苗 (深圳市微生物基因工程重点实验室深圳大学生命科学学院 深圳 518060) 摘要：以红色荧光蛋白作为报告蛋白研究了里氏木霉的纤维素酶合成机理。构建了里氏木霉的表达盒，通过该 表达盒使红色荧光蛋白的基因整合到里氏木霉的基因组DNA上，并受纤维二糖水解酶基因启动子的调控，得到重 组菌株r．reesei 7rR2。在不同的条件下培养7’．煳ei’rR2，红色荧光蛋白的表达情况可以反映在不同条件下里氏木 霉合成纤维素酶的情况。在诱导的情况下，红色荧光蛋白随时问变化的情况与培养液中纤维素酶活性的变化相 似，培养至36h后可以观察到荧光，并且不断增强，到菌丝自溶时荧光减弱。另一方面，诱导后里氏木霉菌丝的各 个部位均可以观察到荧光，而且分布均匀，表明菌丝的各个部位在纤维素酶合成过程中所起的作用相同。在非诱 导的情况下，培养时间较长时也可以观察到较弱的荧光，表明在此条件下里氏木霉仍可以合成少量的纤维素酶，这 一结果为解释纤维素诱导里氏木霉合成纤维素酶的机理提供了另一个试验依据。 关键词：丝状真菌；里氏木霉；红色荧光蛋白；纤维素酶；纤维二糖水解酶 中图分类号：Q939．9文献标识码：A 文章编号：0001—6209(2007)01一0069，06 丝状真菌是一类重要的微生物，被广泛用于抗 因在不同的培养阶段(时间)以及在菌丝的不同形态 生素、酶制剂、有机酸等的生产。与细菌如大肠杆 或部位(空间)的表达，将有利于对以丝状真菌为菌 菌、枯草杆菌等相比，丝状真菌的生长、代谢机理比 种的发酵过程进行优化∞o。 较特殊。一方面，丝状真菌的生长不是由裂殖方式 里氏木霉(m以ode丌mreesei)是重要的纤维素 实现的，而是通过菌丝生长尖端的延伸和在菌丝上 酶产生菌，可以合成至少包括4种内切．13一葡萄糖苷 形成新的分枝来完成的。一些学者根据丝状真菌菌 酶(EG，Ec 丝各部位在生长和代谢中的不同作用将液体培养中 3．2．1．91)和一种纤维二糖酶(BG，EC3．2．1．21)的 纤维素酶系怕’“。在丁．re伽i的纤维素酶系中CBH 的菌丝分为3种形态(rnorphology)，即菌丝生长尖端 工的含量最高旧。。本工作将红色荧光蛋白(DsRed) (apic出companment)、分枝形成段(亦称尖端后部， subapicalcompartment)和菌丝主体(hyphal的基因整合到r．陀es西的染色体上，使之位于在纤 compartment)¨’“。他们认为，丝状真菌在生长时菌维二糖水解酶I基因(c她1)的启动子下游，并使其 丝生长尖端通过软化顶端的细胞壁并不断合成新的 表达受到该启动子的调控。研究了在诱导和非诱导 细胞壁和其它细胞组分而使菌丝延伸；分枝形成段 的情况下DsRed在各个培养阶段以及在菌丝不同部 通过类似的作用产生分枝(也就是新的菌丝生长尖 位的表达情况，进一步阐明了纤维素酶在r．re∞“ 端)；菌丝主体与菌丝的延伸和分枝没有直接的关 中的合成机制，并通过直接的实验手段揭示了丝状 系，但可以合成菌丝生长所需要的一些中间体并向 真菌的不同菌丝形态在代谢产物合成中的作用。 菌丝前端输送，为菌丝的延伸和分枝提供前体。另