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如何如何提高高外源基基因在在E.coli的表表达量 江苏普罗赛生物技术有限公司江苏普罗赛生物技术有限公司 胡伟胡伟 2013.03.01 Transcription Translation 什么是质粒 定义 1，独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。 2，通常为双链环型，但也存在线型。 3，大小可以从几个到几百个kb。 4，带有功能基因。 pBR322 1，，复制子复制子((含有含有DNA复制起始位点的复制起始位点的一段段DNA//ori,,来源于来源于ppMB1))。。 2，选择性标记(amp和tet基因，分别来源于RSF2124、pSC01)。 3，克隆位点。 原件意义 复制子 1，根据所含复制起始区的不同，有些质粒的复制与宿主细胞染色体的复制同步， 每个细胞只含有一个或几个拷贝的质粒，即处于“严密控制”。 2，有些质粒则处于“松弛控制”，每个细胞可含达15-20乃至数百拷贝的质粒。这 类质粒在宿主细胞蛋白质停止合成(加入氯霉素)、染色体DNA停止复制的条件下， 拷拷贝数继续增加数继续增加至数千数千。 抗性基因 11，CChlhloramphheniicoll resiistance ，CCmr 氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。 抗性基因因编码氯霉素乙酰转移酶，在乙酰辅酶A存在的条件下，该蛋白催化 氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合使之不能与核糖体结合。 2，Tetracycline resistance，tetr 四环素与细菌核糖体30S亚基上的16S rRNA结合，抑制amino‐acyl tRNA进入核糖 体体AA‐位置位置。 抗性基因编码一种含399氨基酸残基的膜相关蛋白质，能阻止四环素进入细胞。 3， kanamycin resistance，Kanr 卡那霉素结合细菌核糖体的30S亚基上的16S rRNA，干扰formyl‐methionyl‐tRNA 与与3030SS rRNArRNA的连接的连接，，阻断细菌蛋白质的合成阻断细菌蛋白质的合成。。 抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3‘)‐Ⅱ, 25kDa)的基因，使卡那霉素磷 酸化，从而干扰了其向细胞内的主动转移。 4 ，，amppicillin resistance，，amppr 氨苄青霉素能渗透革兰氏阳性菌及部份革兰氏阴性菌。经由结合在细菌细胞壁 上的青霉素结合蛋白(penicillin‐binding proteins，PBPs)，阻碍细菌合成细胞壁的第 三及最后阶段，最终引致细胞裂解。 抗性基因编码β‐内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素的β‐内酰胺环使之失效，从 而赋予细菌抗药性。 氨氨苄青霉素苄青霉素 羧羧苄青霉素苄青霉素 pET载体 载体原件 T7 promoter/Iac Operator/rbs/His.Tag/T7.Tag/MCS/T7 terminator 启动子及操纵子 Promoter： RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因(gene)的一个组成部分， 控制基因表达控制基因表达((转转 录录))的起始时间和表达的程度的起始时间和表达的程度。启动子启动子(P(Promotters))就像就像 ““开关开关””， 决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸(nucleotides)，那么启动子也应由核 苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录(transcription)因子 的这种蛋白质的这种蛋白质(proteins)(proteins)结合而控制结合而控制 基因活动的基因活动的。 Operat