阿维链霉菌种内原生质体融合选育仅产阿维菌素B的高产菌株.pdfVIP

维普资讯 论 文 第52卷第3期 2007年2月 斜 撂 缸 阿维链霉菌种内原生质体融合选育仅产 阿维菌素B的高产菌株 陈 芝 温 嘉 宋 渊 文 莹 李季伦 (中国农业大学生物学院微生物系，北京 100094．联系人，E-mail：Ⅱjiltin@cau．exlu．cn；syuan@cau．exlu．cn) 摘要 在阿维菌素的8个组分中，B1组分具有最高的杀虫活性，且毒性最小，被广泛应用于农业和畜牧 业生产．本研究对两株阿维链霉菌(阿维菌素高产菌株76—05和仅产阿维菌素B不产寡霉素的基因工程 茵73—12)进行了种内原生质体融合，用以选育仅产阿维菌素B不产寡霉素的高产菌株，获得 了两株具有 双亲优点的重组菌株F23和F29．两重组茵侏均只产阿维菌素B组分不产寡霉素，而且阿维菌素的产量 有很大的提高，分别是亲本菌株 76一O5产量的84．20％和 103．45％，是亲本菌株73—12的2．66和 3．50倍． F23和F29均为遗传稳定的原养型菌株，与亲本菌株高产菌株76—05相比，F29对发酵条件比较宽容．F23 和 F29高产阿维菌素B不产阿维菌素的其他组分和寡霉素的特性有利于阿维菌素的生产，而菌株 F29 对发酵条件相当宽容更有利于其在工业生产中的应用． 关键词 阿维链霉菌 原生质体融合 阿维菌素 寡霉素 阿维菌素是 由阿维链霉菌产生的一组具有相似 分离步骤，简化 了提取工艺，提高了产品质量．然而， 结构的十六元环大环内酯类抗生素，有很强的杀体 阿维链霉菌73—12的产量不高限制了它在工业生产上 内外寄生虫活性 1【】，是 目前最有效的杀虫剂之一，被 的应用． 广泛应用于农业和畜牧业生产中．阿维菌素是 由8个 原生质体融合技术在链霉菌的菌株改 良中被广 结构类似的组分组成，分别为 Ala，Alb，A2a，A2b， 泛应用 ．通过原生质体融合技术也获得了一些具有 Bla，Blb，B2a和B2b，其中B1具有最高的杀虫活性， 优 良性状 的新 的中间产物和杂合抗生素[10,11】．链霉 且毒性最小 2【1．阿维链霉菌除了产生阿维菌素外，还 菌的种 内原生质体融合的融合率很高，在天蓝色链 产生一个二十六元环大环内酯类化合物——寡霉素． 霉菌中可高达 10％～15％，大多数链霉菌的融合率一 寡霉素是哺乳动物细胞氧化磷酸化的抑制剂，具有 般在 0．5％～17％t¨】．Hopwood和 Wrightt12研究表明， 很强的毒性 3【】． 在原生质体融合之前通过 uV 照射灭活原生质体使 鉴于阿维菌素 B组分的杀虫活性高于阿维菌素 存活率约为 1％时，重组率可提高 2～10倍．这可能是 A组分，在阿维链霉菌中选择性合成阿维菌素 B组分 uV 照射会在原生质体 的染色体上引入致死突变，具 具有重要的意义．日本 Kitasato小组通过诱变及其原 有不同致死位点的原生质体可通过融合而互补．链 生质体融合获得了仅产阿维菌素 B，仅产阿维菌素 霉菌原生质体 的高融合率使得原生质体融合技术非 B1a和 B2a两个组分和仅产阿维菌素 B2a的菌株4【]． 常适用于链霉菌 的菌株选育．可将原生质体融合后 由于阿维菌素和寡霉素的生物合成基因簇 已被克隆 所获融合子的孢子(单倍体)悬液涂于非选择性培养 和鉴定p J，因此通过基因阻断的手段构建仅产有效 基，然后对所有的后代进行随机筛选 1【”．近年来，在 组分的基 因工程菌株成为可能．在以前的研究中。通 原生质体融合技术的基础上 ，基 因组改组 (genome 过对阿维链霉菌 76—9中的 aveD基因和整个寡霉素 shuffling)技术的建立，为在弗 氏链霉菌和乳杆菌 中 PKS基因(olmA)分别进行基因缺失，我们获得 了一株 通过对多株正向突变株进行原生质体 回归融合实现 仅产阿维菌素 B不产寡霉素 的基因工程菌 73—1218,9]． 快速育种提供了方便[13,14]． 以该菌株进行生产，纯化阿维菌素 B 时就避免 了繁 为获得仅产阿维菌素 B不产寡霉素的高产菌株， 琐的阿维菌素