ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶Fat-1基因打靶的水牛肾脏成纤维细胞的制备.pdf

畜牧与兽医2013年第45卷第2期 (11)-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶Fat-1基因打靶的 水牛肾脏成纤维细胞的制备 邓廷贤，庞春英，张滢寅，杨炳壮，梁贤威+ (中国农业科学院广西水牛研究所，农业部(广西)水牛遗传繁育重点实验室，广西南宁530001) 摘要：Fat-1基因能协调m·6多聚不饱和脂肪酸与m．3多聚不饱和脂肪酸之间的比例，可提高动物体∞．3多聚不饱和脂肪酸的含量，为提升水牛 乳品质提供r一个有效的方法。本研究构建了水牛乳腺特异性多位点基因打靶载体，分离和培养了新生胎儿水牛肾脏成纤维细胞。采用电击法转 染、克隆环法筛选和纯化了水牛肾脏成纤维细胞克隆，经绿色荧光蛋白表达观察、PCR和DNA序列检测获得了已整合Fat一1基因的细胞克隆，为 制备定点整合Fat一1基因的体细胞克隆水牛提供核移植供体。 关键词：多位点基因打靶；Fat．1；肾脏成纤维细胞；水牛 中图分类号：s811．3 文献标志码：B 文章编号：0529—5130(2013)02—0055．04 基因修饰技术是目前的研究热点，对于转基因动 过外源食物中摄人。已有研究表明，转Fat一1基因均 物研究而言，具有巨大的优势，可任意的对动物基因 组进行整合、敲除或敲入等操作。该技术已广泛应用 的含量，并降低‘I)一6／‘1)．3比值，这一创举可为提高 于动物体内基因组的改造，比如小鼠、猪、牛、羊和 动物性食品的营养价值提高新的途径。而水牛为我国 斑马鱼等。但对于家畜而言，成功应用于小鼠的基因 南方地区重要的畜种，在农业产业结构中占有非常重 编辑技术却不适用于家畜类，比如基因打靶技术，原 要的地位，其乳汁浓厚，奶质优良，堪称乳中极品， 因可能是家畜类动物的生殖和生长周期相对较长…； 有“奶中之王”之称。利用多位点基因打靶技术， 此外基因打靶效率低下，也可能是原因之一。为此， 建立水牛乳腺生物反应器或改善水牛乳品质，生产水 如何将外源基因高效地整合到动物体内是转基因技术 牛奶高附加值产品，对提高奶水牛养殖的经济效益， 研究必须考虑的重要问题。研究表明，多位点基因打 促进水牛奶业的快速发展具有重大的现实意义。为 靶技术是一种以动物细胞核仁组织区非编码DNA重 此，本研究利用电击法和克隆环法筛选和纯化出具有 复列为靶位点进行整合外源基因的打靶技术，该技术 转Fat一1基因的水牛肾脏成纤维细胞克隆，为制备定 已成功的应用于鳜鱼心1和奶牛【31等动物体上的转基 点整合Fat一1基因的体细胞克隆水牛提供核移植供 因研究，均可以提高外源基因整合的效率。这一技术 体，对搭建奶水牛乳腺生物反应器平台具有重要的学 将为家畜的基因修饰开辟了一条新途径。 术意义。 ele— Fat．1基因，来源于秀丽线虫(Caenorhabditis 1材料与方法 gans，C．elegans)，又名09—3多聚不饱和脂肪酸脱氢 1．1材料 酶基因Fat．1，其编码产物是(I)．3多聚不饱和脂肪酸 脱氢酶，该酶以(I)-6多聚不饱和脂肪酸(Omega-6 acids，(1)一6PUFAs)为优先底物， polyunsaturatedfatty 24孔板、12孔板、6孑L板、培养皿和细胞冻存管均 使其脱氢转化为c0—3多聚不饱和脂肪酸(Omega-3 PUFAs DNA polyunsaturatedfattyacids，to-3PUFAs)‘4I。(1)．3 为美国Coming公司产品。LATaq xGC