幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因克隆表达及免疫评价.pdf

郑州人学2005年博士论文 幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋向基因克隆表达及免疫评价 幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因 克隆表达及免疫评价 博士研究生 康巧珍 导 师 段广才 郑州大学公共卫生学院郑州450052 摘 要 pylori，H删fD，f)是一种微需氧革兰氏阴性螺旋杆 幽门螺杆菌(Helicobacter 菌，在全球人口中的感染率超过50％。爿=pylori感染多发生在儿童时期，如果不 经治疗，H．pylori在胃中的持续慢性感染可导致胃炎、消化道溃疡等疾病，并与 胃癌、胃黏膜相关性淋巴样组织(MALT)淋巴瘤发生密切相关。研制疫苗将是 控制H．pylori感染及相关疾病经济有效的途径。 Hpylori水抽提物中存在着一种能趋化并激活中性白细胞的可溶性蛋白，被 protein， 称作幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白(H．pylorineutrophit-activating HP-NAP)。HP-NAP位于幽门螺杆菌细胞质中，可通过细菌自溶而释放，并附着 在细菌外膜的表面，HP-NAP对高分子量碳水化合物具有特异亲和力，处于这样 的位置HP-NAP可能介导幽门螺杆菌粘附于缩主胃黏膜上皮细胞表面。多数姓 的重要因子和疫苗候选抗原。 本研究利用PCR方法从H 预测，DNA重组技术构建原核表达载体，并对其编码产物的免疫原性、免疫反 应性进行研究，从阻断珏pylori黏附与定植的角度观察HP-NAP在动物模型中的 免疫保护效果，以评价其在发展Hpylori基因工程疫苗中的作用，为免疫接种预 防Hpylori感染，减少Hpylori相关疾病奠定基础。 实验方法 1．且pyloriMEL-HP27菌株HP-napA基因的分子克隆及序列分析 郊州火学2005年博士论文 幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因克隆表达及免疫评价 利用NCBI BLAST,Omiga2．0等生物信息软件对国际互联网上公开发表的H ／)3，lori26695和HpyloriJ99蛋白质组及基因组数据进行分析处理，初步筛选抗幽 5．0自行设计PCR引 门螺杆菌基因工程疫苗候选基因且P．napA。利用软件Primer 物，Pyrobest高保真DNA聚合酶从／-f 测序鉴定；生物信息技术对HP-napA序列进行同源性分析，并对其编码产物的化 学性质包括分子量、溶解性、等电点、保守结构域和免疫活性等进行预测评价。 达载体pMAL．c2X，构建幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因与大肠杆菌麦芽糖 细胞，氨苄青霉索抗性、蓝．白斑试验筛选阳性克隆，限制性内切酶酶切及特异 Blot 鉴定融合蛋白rMBP-NAP。优化诱导表达条件，筛选高效表达菌株。利用Amersham FPLC Western Blot鉴定活性峰，Xa因子切除标签蛋白MBP，DEAE阴离子交换柱层 定蛋白质含量。 3．rHP-NAP免疫原性及免疫反应性研究 用纯化的重组抗原加弗氏佐剂免疫实验兔，动态观察triP-NAP特异性抗体产 生规律，免疫双扩散法、ELISA法测定抗体效价，评价rHP-NAP免疫原性。以 免疫反应性及HP-NAP在宿主免疫反应中的作用。纯化triP-NAP多克隆抗体， 通过体外实验评价rHP-NAP及其特异抗体在H pylori与胃癌细胞株BGC823黏 附过程中的作用。 4．rHP．NAP经口免疫在动物模型中的免疫保护作用 利用SPF级BALB／e小鼠和CV级豚鼠构建Hpylori定植模型，以rHP-NAP 为抗原，重组霍乱毒素为黏膜佐剂，以不同的抗原剂量和不同的免疫程序经口免 疫小鼠和豚鼠，然后用H