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实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 中科大生命学院仪器实验中心 梁长流 2007-9-17 提纲： 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用 实时荧光定量PCR 定义： 在PCR反应体系中加入 荧光基团，利用荧 光信号累积实现了实时监测整个PCR进程， 对起始模板进行定量分析的方法。 与普通PCR的区别 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始 模板进行定量。 量 号 信 光 荧 ： 轴 纵 横轴：PCR反映循环数 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 Ct值 Ct值的定义： 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的 扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。 C(t) value 定量PCR的数学原理 •理想的PCR反应： X=X *2n 0 • 非理想的PCR反应： n X=X0 (1+Ex) n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0 ：初始模板量 Ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时: Ct X =X (1+Ex) =M (1) Ct 0 XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: Ct log M=log X0 (1+Ex) (2) 整理方程式(2)得: log X = - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) 0 最后结论： Log X 与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计 0 算出样品中所含的模板量 标准曲线 Log起始拷贝量与Ct呈线性关系，通过已知起始拷 贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就 可以计算出样品中所含的模板量 提纲： 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用 DNA 产物的荧光标记 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 方法1--SYBR Green法工作机理 SYBR Green SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 在延伸结束阶段采集荧光信号。 SYBR Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所以 必须在反应结束时做熔解曲线分析。