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MicroRNA24 对碘酸钠造成的视网膜损伤的保护作用的实验研究 中文摘要 MicroRNA24 对碘酸钠造成的视网膜损伤的 保护作用的实验研究 中文摘要 背 景：视网膜疾病是一类严重影响人类视力及生活质量的疾病。视网膜的损伤 尤其是视网膜上皮层的损伤，至今临床上尚无发现可靠有效的治疗方法。随着医学发 展，采用药物、手术、激光等虽可控制病情，但无法从根本上治疗基因缺陷。而基因 治疗越来越受到关注。随着对microRNAs 家族研究的深入，microRNA24 的基因功能 引起研究热潮。目前国内就microRNA24 对眼科疾病尤其是视网膜损伤的作用机制的 研究尚不多见。 目 的：将包装好的慢病毒载体分别用于细胞实验和动物实验，分别检测在体外 和体内碘酸钠刺激的情况下，microRNA24 的表达对碘酸钠造成的ARPE-19 的损伤是 否具有保护作用。 方 法：（1）根据目的基因构建慢病毒载体，然后进行慢病毒包装、收获及浓缩， 并且进行滴度的测定。（2 ）细胞实验：分别用0.3mg/ml, 0.6mg/ml, 1.2mg/ml, 2.4mg/ml, 4.8mg/ml,9.6mg/ml 浓度的碘酸钠刺激视网膜上的不同细胞（ARPE-19,Muller,RGC-5 ）， 比较视网膜上各种细胞对碘酸钠的敏感性，为动物模型的建立提供依据。分别加入 5μl，10μl，15μl 的包装好的病毒，让其感染ARPE-19 细胞，比较不同剂量感染后的 ARPE-19 细胞与单纯ARPE-19 对碘酸钠刺激的敏感性是否有改变。（3 ）动物实验： 取160g 左右的SD 大鼠20 只，分为2 组，裂隙灯及眼底镜检查排除角膜疾病，白内 障及眼底疾病，ERG 检查排除左右眼a 波及b 波振幅有差异者。第一组先按50mg/kg 的剂量尾静脉注射碘酸钠溶液，2 天后进行视网膜下腔病毒注射，统一规定右眼注射 病毒5μl，左眼注射同等体积的灭菌的PBS 溶液。第二组预先1 周注射病毒，按照第 一组的注射标准与方式，1 周后再进行尾静脉注射碘酸钠溶液。两组分别于注射完成 后1 周，2 周，4 周，6 周进行ERG 检查，统计a 波及b 波振幅，看有无统计学差异。 结 果：（1）成功构建了慢病毒载体，并且测试病毒滴度为2E+7TU/μl 。（2 ） 细胞实验：经不同浓度碘酸钠作用48h 后，三种细胞（ARPE-19,Muller,RGC-5 ）IC50 I 中文摘要 MicroRNA24 对碘酸钠造成的视网膜损伤的保护作用的实验研究 分别为（2.26±0.12 ）、(2.34±0.76)、(2.13±0.69)mg/ml 。说明三种细胞对碘酸钠的敏感 性依次为RGC-5ARPEMuller 。对于每种细胞，随着碘酸钠浓度的升高，其存活率 降低。分别收集24h,48h,72h 病毒感染的ARPE-19 细胞，不同剂量病毒感染后的细胞 (ARPE-19+5μl，ARPE-19+10μl，ARPE+15μl) 的IC50 分别为（2.49±0.32）、（3.62±0.42 ）、 （4.83±0.51 ）mg/ml 。说明不同剂量病毒感染后ARPE- 19 的 50%碘酸钠抑制度浓度 均较单纯ARPE-19 细胞明显升高（P0.05 ，=0.05 ），而（ARPE+15μl ）组相对单纯 ARPE-19 组升高更显著（P0.05 ，=0.05 ）。即在相同浓度的碘酸钠刺激下， （ARPE+15μl ）组细胞存活率最高。这初步说明microRNA24 对ARPE-19 细胞是有 保护作用的。而且这种保护作用在高剂量病毒组效果更显著。（3 ）动物实验：两组在 1w，2w ，4w 周后做ERG 检查，五个强度下左右两眼a 波及b 波均无振幅，对比无 统计学差异 （P0.05 ）。在第6 周做ERG 检查，五个强度下两组均a 波及b 波均有振 幅，但比较两组在五个强度下的a 波及b 波振幅并无统计学差异 （P0.05 ）。 结 论：大鼠尾静脉注射碘酸钠可选择性破坏视网膜色素上皮细胞，成功建立视 网膜损伤的动物模型；病毒感染的ARPE-19 细胞对碘酸钠刺激有抵抗作用，细胞存 活率增高，说明microRNA24