霍乱弧菌tcpA基因克隆表达及免疫保护作用研究.pdf

摘要 霍乱弧菌(Vibriocholerae，VC)是水产动物中常见的、危害最大的病原菌之一， 不仅可引起鱼类严重的脱黏病和细菌性肠炎，而且还可通过水产品感染人类，引起人 类烈性肠道传染病。目前控制该病的主要手段是使用抗菌药物，但是由于该菌感染的 普遍性、耐药菌株的不断增加，在很大程度上限制了抗菌药物的疗效。因此，该病免 疫防治的研究具有重要意义。鉴于霍乱弧菌通过毒素共调菌毛(toxin-eoregulatedpilus， Top)黏附定植于小肠黏膜是其致病的前提，阻断霍乱弧菌的黏附定植即可防止感染 的发生。对此，本研究选择暴露于细菌表面并与霍乱弧菌黏附定植密切相关的黏附素 TcpA为目标，通过基因工程技术获得重组蛋白GST-TcpA，研究其免疫保护作用，以 确定重组TepA蛋白在霍乱弧菌基因工程亚单位疫苗研制中的应用价值。 核苷酸组成，开放阅读框完整无中断，编码由224个氨基酸组成的相对分子量约为 21 乱弧菌参考株之间均具有较高的同源性，彼此间的核苷酸序列和推导的氨基酸序列同 和表达奠定了基础。 I I和Xho 中表达。根据pGEX-4T-1表达载体阅读框的要求，设计l对包含BamH I／Xho PCR产物经BamH I双酶切后，亚克隆到表达载体pGEX-4T．1中，并转化至 形式高效表达分子量约47．O kD的重组蛋白GST-TcpA，并经提纯后获得大量的该重 组蛋白，从而为进一步研究其免疫保护作用奠定了基础。 blot、细胞黏附抑制试验和免疫保护性试验测定重组蛋 最后，分别采用Western 表达产物经SDS．PAGE分离后，转移至PVDF膜，以霍乱弧菌菌毛蛋白抗血清为一 异性免疫反应，证实重组TcpA蛋白保持了天然Top蛋白的抗原性。以霍乱弧菌菌体、 霍乱弧菌菌毛蛋白、重组蛋白GST-TcpA和GST蛋白分别免疫小鼠制备抗血清，检 测这四种抗血清在细胞黏附抑制试验中的作用。结果显示菌体抗血清可完全抑制细 菌对HEp．2细胞的黏附，菌毛抗血清和重组蛋白抗血清可明显降低细菌对HEp．2 细胞的黏附，而GST抗血清无黏附抑制作用。表明重组蛋白抗血清在体外能明显抑 制霍乱弧菌Yl菌株对HEp一2细胞的黏附作用，除Tep外，霍乱弧菌Yl菌株尚表达 其它黏附素。实验小鼠分别经纯化重组蛋白GST-TepA和GST蛋白四次免疫后，用 Y1株菌液进行攻击，结果显示重组蛋白免疫组小鼠的免疫保护率为81．25％，而GST 免疫组小鼠和生理盐水对照组小鼠全部死亡。说明重组TcpA蛋白对霍乱弧菌感染具 有较好的免疫保护作用。 保护作用，在霍乱弧菌基因工程疫苗的研制中具有潜在的应用价值。 关键词：霍乱弧菌，tcpA基因，克隆表达，免疫保护作用 Ⅱ Abstract HbrioCholeraeisoneofthemostcommonand in damagingpathogenaquaculture， not leadstoseriousmucous diseaseandbacterialenteritisoffishbut which orgy sloughing alsocauseshuman’S intestinalinfectiousdiseasesCholerac potent byaquaticproducts．At meanstocontrolthediseaseistouse theeffectsofits present，theprimary an