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PCR失败原因分析 一 模板质量问题： 1. 模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提 取的 DNA ，PCR 阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题，可以增加模 板量试试，但不一定行得通。 2. 模板里面残留某种试剂成份，可能抑制 Taq 聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试 剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。 3.为什么跑电泳会出现拖带呢？ ①有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关，其中就有一个是电压，在适 当的电压范围内增加是可以加快迁移速率，但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当 的调低点看看。 ②有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ，按 1:50 或 1:100 等稀释 后，再当成模板扩一次怎么样。 二 引物问题 1. 样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的 好，而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利！ 2.普通 PCR 所用的一对引物中有一个引物加多了，为正常的三倍只要引物特异性比较好， 那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话，也许会扩出来非特异 带。 在制备单链探针时候就采取这样的不对称 pcr ，没关系的 三 Taq 酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。 1.1 假阴性，不出现扩增条带 可能原因： （1）模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有 Taq 酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚，模板本身拷 贝数低；⑤模板核酸变性不彻底。 对策：纯化模板；配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改；如果怀疑 污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀 DNA 。 （2 ）酶失活 对策：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴 性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 （3 ）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条 浓度低，造成低效率的不对称扩增， 对策：①选定一个好的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做 琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有 条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引 物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止 多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度 不够引物之间形成二聚体等，需重新设计引物。 （4 ）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的 特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 对策：调整 Mg2+浓度，从 1mM 到 3mM，间隔 0.5mM 进行一系列反应，确定对于每个模 板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量 PCR ，使用 3mM 到 5mM 的镁离子浓度。 （5 ）反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为 20ul 、30ul、50ul 。或 100ul，应用 多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后， 再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。 （6 ）物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物 与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。 对策：优化 PCR 温度，有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、 退火和延伸温度。 （7 ）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。 1.2 假阳性：出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 可能原因： （1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR 扩增 时，扩增出的PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。 对策：需重新设计引物。 （2 ）靶序列