PCR技术应用十HIV感染.pdfVIP

中国试剂网 3.9.53 PCR 技术应用十：HIV 感染 八十年代以来由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS) 因其严重的 危害性而受到人们高度重视，力争早期诊断和寻求有效治疗是防止其广泛传播的 关键所在.聚合酶链反应(PCR)具有敏感、特异和快速的特点，是检测病毒、评价 病情进展和探讨发病机理的有效工具. 一、HIV 的基因结构 HIV 的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA 双分子，其单链RNA 分子由 9749 个核苷酸组成，有 3 组共 9 个基因。第一组为逆转录病毒共同的基 因，即gag、pol 和 env 基因，及侧翼的长末端重复顺序(LTR)等.其中前三者为病 毒的结构基因，编码病毒蛋白，而基因组两端的 LTRs ，不编码任何蛋白，可起 始其它病毒基因的表达，无种属特异性.第二组为调节基因表达的基因，即 tat 、 rev 和 nef 基因，可以增强或抑制其它基因的表达.第三组为特有基因，负调控病 毒的感染性，成熟或释放，即vif 、vpu 和 vpr.HIV 有十分高的遗传变异率，它是 一个多态性病毒，从不同的AIDS 患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异， 事实上，独立分离到的 HIV1 和 2 彼此都不相同，这是由于病毒传播过程中突变， 缺失或插入引起的，高度变异区在 env 基因内，相当于 gp120 的五个区段，gag 和 pol 基因较少变异，因此，只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因 加以扩增，才能有效地检测所有 HIV 的变异性. 目前已知HIV 有两个型，HIV1 是从欧洲和美洲分离毒株的总称，亚洲地区的流行株也基本上为 HIV1 ，HIV2 是从西非的妓女分离的毒株. 二、PCR 在鉴定 HIV 感染中的意义 HIV 常可引起潜伏感染，但仍具有传染性，整合的病毒基因组在每个细胞中 仅以很低的 DNA 拷贝数存在，因此，需要建立一个敏感而又特异的HIV 检测方 法.传统的检测途经很多，包括外周血抗原测定，病毒分离和逆转录酶法等，但 均费时费力，稳定性也差.核酸杂交虽有一定的特异性，敏感性却较低，利用原 位杂交发现 AIDS 患者仅有 104～105 之一的细胞有含有 HIV1DNA ，实际上远 不至此.聚合酶链反应被称为无细胞的分子克隆技术(cellfreemolecularcloning)， 自 1987 年即被用于 AIDS 的研究中.Ou 利用针对 HIV1LTR ，gag 和 env 基因的 三对引物对 HIV 血清学和病毒分离均阳性与血清学阳性，但病毒分离阴性的男 中国试剂网 3.9.53 性同性恋者进行外周血单个核细胞(PBMC)前病毒 DNA 序列的测定，发现前者 的阳性率为 100%，后者也可达 60%，对照组则均为阴性，因此提出PCR 可以作 为病毒分离的替代方法.Imagawa 将 PCR 与其他几种传统方法进行比较，结果在 分离出 HIV1 前，具有血清阳转的 4 例男性中 3 例可用 PCR 检测出外周血淋巴 细胞中 gag 基因的存在，这种阳性反应可发生在血清阳转前 38～42 个月，而在 得出 PCR 阳性结果前，无一例分离出病毒，因而认为，对仍从事高危活动(如吸 毒、同性恋等) 的血清阳性个体，PCR 能有效地发现 HIV 感染者的存在.此外，临 床上 AIDS 患者常出现神经症状，而在许多血清学阳性个体的脑脊液(CSF)中却 未分离出 HIV1 ，因而难以确定病毒的侵袭范围.利用 PCR 技术已经证实了 CSF 中存在着前病毒DNA 和游离病毒 RNA 序列，而且 RNA 量似乎比 DNA 更为丰 富.至于 CSF 中病毒序列的存在是否与神经系统的损害有关，目前仍存在不同意 见，但至少无症状感染者 CSF 中 HIV1 的存在对阐明与 HIV1 相关的神经损害 具有重要意义. 研究表明，HIV 感染的女性所生的婴儿中有 30～59%可在宫内、分娩过程 或产后哺乳期感染该病毒，但由于婴儿体内存在来自母体的抗体且可持续 15 个 月左右，同时又缺乏检测 IgM 型抗体的手段等