IRF-2在胰腺癌中的功能及对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响.pdf

IRF-2在胰腺癌中的功能及其对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响 IRF．2在胰腺癌中的功能及其对胰腺癌细胞 化疗敏感性的影响 中文摘要 胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤。虽然近年来诊断和治疗技术不断提高， 但胰腺癌病人生存状况仍不容乐观，这与胰腺癌发病机制复杂，多种基因参与调 控，缺少有效的治疗靶点等有关。干扰素调控因子2(Ⅱ心．2)是干扰素调控因 子家族的一员，其功能涉及免疫调节和肿瘤的发生发展。已有的研究表明，干扰 素调控因子2参与了乳腺癌、黑色素瘤、食管癌等多种肿瘤的形成，但是其在胰 腺癌中还未见系统性的功能研究。 在本课题中，我们研究了IRF．2基因在胰腺癌中的功能，着重进行了以下四 个部分的工作：(1)构建IRF．2基因RNA干扰的载体，并在胰腺癌细胞系中稳 定沉默IRF．2的表达；(2)研究IRF．2对胰腺癌细胞系生长、增殖、侵袭、转移 等生物学特性的影响，并进一步阐述其机制；(3)探讨胰腺癌细胞IRF．2沉默以 后对吉西他滨化疗敏感性的影响；(4)结合临床数据，探讨IRF．2在胰腺癌临床 样本中的表达情况，并分析IRF．2的表达与病人临床病理指标及预后的关系。 第一部分：IRF．2基因siRNA载体的构建 目的：构建IRF．2基因的siRNA载体，并检测其效果。 mRNA不同位点的特异性siRNA序列，合成寡核苷 方法：首先设计针对IRF．2 酸，然后将其连接到pBS,hU6．1载体上；选择合适的酶切位点与慢病毒载体FGl2 相连，琼脂糖电泳及测序鉴定。然后进行大肠杆菌转化，质粒大量抽提。获得的 质粒，转染293T细胞进行病毒包装。最后用病毒感染胰腺癌细胞，检测干扰效 果。 功将序列转移到FGl2慢病毒载体上。在包装病毒及感染胰腺癌细胞系后，用 Western blot检测，实验结果表明效果较好，成功构建了下调IRF．2表达的 MIAPaCa-2和PANC．1胰腺癌细胞株。 结论：成功构建IRF．2siRNA载体，获得下调IRF．2表达的稳定胰腺癌细胞株。 关键词：干扰素调控因子2：RNA干扰；胰腺癌 IRF-2在胰腺癌中的功能及其对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响 第二部分沉默IRF．2对胰腺癌细胞生物学特性的影响 目的：研究沉默IRF．2表达对胰腺癌细胞生长、增殖、侵袭、转移等的影响。 方法：在得到稳定干扰IRF一2表达的胰腺癌细胞株后，通过MTT、BrdU掺入实 验、结晶紫实验、软琼脂克隆形成实验、裸鼠体内成瘤实验、细胞迁移实验、裸 鼠体内转移实验等检验胰腺癌细胞系生长、增殖、侵袭、转移等生物学特点的变 化，并且进一步从细胞周期改变及细胞凋亡方面阐述其机制。 结果：MTT实验、BrdU掺入实验、结晶紫实验结果证实沉默IRF．2的表达抑制 细胞的生长、增殖能力(PO．05)。软琼脂克隆形成实验、裸鼠体内成瘤实验表 明下调IRF一2的表达以后胰腺癌细胞株的成瘤能力明显下降。流式细胞实验表明 下调IRF一2的表达后胰腺癌细胞株的凋亡比例明显上升俨0．05)，细胞G0．G1 期阻滞增加，S期细胞比例明显下降(PO．05)。进一步实验表明下调IRF．2的表 达后，与生长、增殖相关的基因PCNA、CyclinDl明显下调；与凋亡相关的PARP、 BAX、Caspase．8基因明显上调。细胞迁移实验、裸鼠体内转移实验发现下调IRF一2 的表达对胰腺癌细胞系侵袭、转移没有明显影响。 和成瘤能力有着明显的抑制作用，而这种作用是通过改变细胞周期和细胞凋亡来 实现；但是下调IRF．2表达对于细胞侵袭、转移能力没有明显的影响。 关键词：干扰素调控因子2；RNA干扰；生长和增殖；细胞周期；细胞凋亡 第三部分沉默IRF-2对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响 目的： 探讨沉默IRF．2以后对胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响。 (IC50)，了解这两种细胞对吉西他滨的化疗敏感程度，选取相对耐药的细胞进 一步探讨沉默IRF．2表达对细胞吉西他滨的化疗敏感性的影响。MTT检测干扰 IRF．2基因后细胞对吉西他滨敏感性的变化。结晶紫实验和裸鼠移植瘤模型检测 干扰IRF．2后是否增强吉西他滨对体外细胞克隆形成及体内成瘤能力的抑制作 blot 用。流式细胞技术检测沉默IRF一2基因前后细胞周期和