TGF-β-%2c1-基因转染联合BMC%2fMSCs诱导嵌合体在异种心脏移植免疫耐受中作用的实验的研究.pdf

TGF-BI雉阵【转染联仓BMC／MSCs诱导嵌合体√I：异种心吐移植免疫耐蹙中作甩的实验研兜 中殳摘复 引物PCR扩增出目的基因片段PCR3(基因内PstI酶切位点ctgcag—ctgcaa同义点 pGEZ-Term-TGF．DI，并经PCR、双酶切和DNA测序鉴定。 析(重组)逆转录病毒在293T细胞中的包装成熟和裂细胞释放。 采用成年豚鼠用贴壁法分离骨髓间充质干细胞并传代培养，观察其生长和增殖特 性，耿第三代培养细胞做细胞生长曲线测定。 获得的具有感染能力的成熟重组逆转录病毒感染骨髓MSCs，经Zeocin筛选获得 Western blot和ELISA检测大鼠TGF-IBl目的基因的转录、整合和表达。 3、选用雄性豚鼠和雌性SD大鼠为供受体，随机将36只大鼠分为六组：所有大 鼠受体接受60Coy射线全身照射，照射后4h内经尾静脉输注不同细胞，两天后经环 磷酰胺注射处理。A组为对照组，输注生理熊水：B组输注豚鼠骨髓细胞(BMC)： 测定来探讨耐受机制，并连续检测了外周淋巴细胞的变化，流式细胞仪检测了T淋巴 IL-10细胞因 细胞亚群的变化，用ELISA法检测细胞移植后受体内IFN吖和IL4、 子的表达。 用Ono法行腹腔异种异位心脏移植，记录移植物存活时间，检测移植物病理组织学， ＼＼＼＼＼＼， 并进行统计学分析 结果： II 中立摘罄 TGF．且1桀H转染联合BMC／MSCs西导嵌合体机异种心脏移植免疫耐受中作用的实验研究 报道的序列完全一致。 2、利用PCR法扩增了Pst 鉴定表明在293T细胞中包装获得了具有感染能力的成熟重组逆转录病毒；全培养骨 髓细胞并连续2~3 d换液，1¨14天后贴壁的纤维状细胞融合成片，得到梭形的骨髓 blot和ELISA检测表明获得 间充质干细胞；经GFP观察、RT-PCR、PCR、Western 了稳定表达大鼠TGF．B1的转基因MSCs。 检测到，MLR显示耐受大鼠呈供者特异性耐受。两次注射者其MLR刺激效因较其他 组明显降低。外周淋巴细胞在全身辐照后下降，于第七天达到最低，随后逐渐升高到 处理后35天仅升至『F常水平的20％。T淋巴细胞亚群也呈明显的降低，特别是CD3+ 基因转染的BM．MSCs后，出现了两类细胞因子的偏移。 4、移植物的平均存活时间：A组为3 管性排斥反应(AVR)改变，E、F组移植物炎症细胞浸润数减少。 结论： I酶切位点同义点 1、成功克隆了大鼠TGF．131基因和构建了TGF．13l基因内Pst 突变的pGEZ．Term．TGF．131。 2、贴壁法可用于分离骨髓间充质干细胞；并获得了以逆转录病毒载体介导的稳 定表达大鼠TGF．B1的骨髓MSCs。 3、通过在非清髓性法预处理后输注供体骨髓细胞(BMC)或骨髓问充质干细胞 (BM．MSCs)，可以建立混合嵌合体，诱导免疫耐受。通过骨髓细胞输注后再次注射 表达强化免疫耐受。 4、联合应用混合嵌合体和TGF．Bl预处理可明显延长非协调性异种移植物存活