农杆菌介导的黑麦草丛生芽芽尖的遗传转化及转基因植株再生.pdf

山东大学硕士论文 摘要 黑麦草是具有世界栽培意义的禾本科牧草和草坪草，其遗传转化常用的方法是基 因枪法，此外有硅碳纤维介导法以及农杆菌介导法，受体体系一般是经离体培养获得 的胚性愈伤组织、悬浮细胞系和原生质体．目前黑麦草遗传转化方法尚存在一些缺点， 如组织培养时间长、受基因型限制、愈伤组织经长期继代培养易出现体细胞无性系变 异、转化周期长等，只从少数品种获得了少量的转基因植株．因此，建立一套高效、 快速、不受基因型限制的黑麦草遗传转化体系是加快黑麦草基因工程发展的关键． 本工作以优良黑麦草栽培品种海湾(一年生)、泰垂莱特(多年生)的黄化丛生芽 的裸露芽尖分生组织作为遗传转化的受体，通过农杆菌介导法进行遗传转化，将来自 大肠杆菌编码胆碱脱氢酶的betA基因转入两种基因型黑麦草细胞中，获得了可育的转 基因植株。研究了影响黑麦草芽尖转化效率的因素，优化了转化体系．具体内容如下： 黑麦草离体丛生芽培养体系的建立：以黑麦草无菌种子苗的茎尖生长点部分为外 2，4．D的诱导培养基上诱导丛生芽发生，在附 植体，在附加2．0mg／L6-BA和0．5mg／L 加2．0mg／L6-BA的增殖培养基上继代培养，建立起高效的黑麦草丛生芽离体培养体 系． 黑麦草丛生芽芽尖的遗传转化：取在增殖培养基上培养8-10天的丛生芽块剥成 Imm大小的单芽或小芽块，尽可能地裸露出生长点，在携带质粒 浸染，同时在0．5×105Pa负压下处理5rain，无菌滤纸略吸小芽块上的残留菌液后，于 丛生芽增殖培养基上共培养3天，然后转移到加有100me／L头孢霉素的抑菌培养基上 培养8天，再转移到加有3-5mg／L绿磺隆的筛选培养基上连续筛选3代，每代15天． 存活的小芽在无除草剂的培养基上恢复培养后，转入生根培养基，20天后，移栽入上 层蛭石，下层壤土的花盆中．2个月后对移栽成活植株进行PCR检测，确定转基因植 株． 研究了影响黑麦草遗传转化效率的因素，优化了转化条件，以继代培养8-10天的 负压下浸染5rain，抗性芽比例较高，最高达到32．7％。该转化体系以黄化丛生芽裸露 芽尖为转化受体，基因型依赖性小，仅需3-4个月即可获得转基因植株，且转化效率 较高，这为黑麦草基因工程育种打下了良好的基础。 转基因植株小区开放授粉收获后代后，对Tl代进行了分子检测和耐盐性分析·在 检测的21个株系中，有3个株系后代表现PCR阳性，说明通过农杆菌介导的方法转 化黑麦草芽尖获得可遗传的转基因植株是可行的．Tl代种子和对照播于沙盆中，先经 1．0％盐水浇灌10天，然后用2．0％的盐水浇灌，30天后统计植株成活率，结果表明转 基因植株子代的耐盐性相对于对照提高了至少0．5％NaCI浓度· a／s 关键词：一年生黑麦草多年生黑麦草丛生芽遗传转化beta V1 山东大擘硕士论文 Abstract speciesinthe world．Genetic contnbutc幻theof cultivarsfor engineeringmay development improvedryegrass forage andturf esconventionalselection of have purpose been pfo∞dBre缸slow．Tramgenicplantsryegrass 砖p。哪cd silimn-carbidefibre-m