细胞转录因子E2F1对下游基因的调控及其生物学功能及研究.pdfVIP

细胞转录因子E2F1对下游基因的调控及其生物学功能研究 摘 要 细胞内重要的转录因子E2F1是E2F家族中第一个被克隆出来的蛋白，对细胞的 增殖、分化和凋亡都发挥着关键性的作用。E2F1参与了细胞周期从G1期到S期的转 换：在细胞周期G1期前，Rb与E2F1结合限制了其活性，当细胞周期蛋白激酶CDK 因组上，发挥转录调控功能激活下游基因，进而使细胞周期从G1期转换到S期。同 时，E2F1还发挥促凋亡功能，通过p53依赖型以及p53非依赖型两种细胞信号通路， 进而激活下游促凋亡蛋白如：Bcl一2 PUMA，Noxa，Bim， homology3(BH3)一onlyproteins NF．r．B．Mcl．1等。通过E2F1这两方面的作用，最终带来细胞的凋亡。因此，转录因 子E2F1与肿瘤的治疗有很密切的关系，以E2F1作为肿瘤药物靶点的研究显得尤为重 要。 由于转录因子E2F1在细胞周期和细胞凋亡中发挥着关键性的作用，为了研究 融合蛋白的H1299细胞株进行研究。该细胞株能够稳定表达大量融合蛋白ER．E2FI， 这样细胞内这些融合蛋白就会与细胞膜上的大量配体相结合，从而将ER．E2F1固定在 细胞核之外。当加入雌激素受体抑制剂(4一OHT)处理一段时间后，ER．E2F1与细胞膜 上的配体的结合就会被打断，大量的ER．E2F1就会进入细胞核内发挥E2F1的转录调 控功能。本论文首先是建立并通过G418筛选出稳定表达HA．ER．E2F1融合蛋白的 blot H1299细胞株；其次，在雌激素受体抑制剂(4．OHT)处理的情况下，通过western 技术检测发现E2F1能够在蛋白水平上激活下游蛋白DP．1和B．Raf；再次，用细胞株 H1299和Hela,在瞬时转染质粒HA．E2F1的情况下，通过westernblot技术和免疫荧 光染色技术分别证实E2F1在蛋白水平上激活下游蛋白DP．1和B—Ra￡最后，利用 在转录水平上激活DP．1． 在本论文所建立的E2F1对其下游基因调控的稳定表达系统中，融合蛋白ER．E2F1 在细胞内是大量表达的，我们只是通过雌激素受体抑制剂(4．OHT)来改变该蛋白的细 胞空间定位，进而在人为可控的情况下来研究E2F1对其下游基因的调控。我们的结 异二聚体的形成与功能具有重要意义；同时，本论文所揭示的E2F1蛋白与B．Raf蛋 S 白的关系，对于探讨E2F1与细胞周期以及细胞肿瘤的关系具有一定的积极意义。 转录因子E2F1，DP-1，B—RaE 关键词：ER．E2F1，雌激素受体抑制剂， 6 downstreamand function ofthe biological by Regulation genes factorE2F1 transcriptional ABSTRACT Thecellular factorE2FI．thefirstcloned intheE2F transcriptional gene important a roleinthecellular 1 family,plays apoptosis．E2F key proliferation，differentiation，and