荧光原位杂交的染色体分析.pdfVIP

中国试剂网 3.9.249 荧光原位杂交的染色体分析 （一）标本的制备 1．室温下，依次用70 ％、90 ％和100％的乙醇脱水5min 。 2 ．空气干燥载玻片。 3 ．若短期使用，载玻片可在室温贮存数天。若载玻片要长期保存，应在室温下 过夜使组织 “老化”（aged ），然后放入容器中，该容器密封于含干燥剂的塑料袋 内，－70℃保存。根据作者的经验，在6 个月内使用的载玻片可贮存在－20 ℃。 在杂交实验之前解冻这些载玻片，不提倡反复冻融载玻片。 （二）缺口平移法标记探针 通过缺口平移法生物素 （酰）化DNA 探针 1．结合：2 μg 探针DNA ，10 μl 10 ×反应缓冲液，10 μl β－巯基乙醇，10 μl 核苷酸母液 （含0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5mmol/L dGTP, 0.5mmol/L 生物素-16-dUTP 和0.12mmol/L dTTP ），20 单位DNA 聚合酶I 和 1：1000 稀释 的DNase I，加双蒸水至100 μl （最后加酶）。 2 ．在15℃温育2h 。 3 ．置反应混合物于冰浴直至反应产物的大小被确定。 4 ．凝胶电泳检测探针分子的长度：取10 μl 反应混合物，加入凝胶上样缓冲液， 水浴箱中煮沸2～3 分钟使其变性，冰浴3min，上样到1～2 ％的琼脂糖微型凝胶 中，并以适当大小的标准品做对照，以50V/cm 电泳3min 。用浓度为0.5 μg/ml 的溴化乙锭染胶，在紫外透照仪上显示DNA 并拍照。 5 ．对于最佳的杂交条件，探针 （可见一脱尾）应为100～500nt 。根据电泳结果 进行下述步骤： a. 如果探针大小在期望的范围内，进行步骤6 。 b. 如果探针太大，可加入更多的DNase I ，在15℃温育。 c. 如果探针未完全消化，纯化探针并重复缺口平移法。 d. 如果探针太短，用较少的DNase 重复反应。 6 ．为使DNase 失活，加入2 μl 0.5mol/L EDTA 和1 μl SDS ，在68℃加热10min。 7 ．用离心柱凝胶过滤法从标记的探针中分离出未掺入的核苷酸： 中国试剂网 3.9.249 a. 用1ml注射器装入硅胶玻璃棉至0.2ml 刻度处，加经缓冲液平衡的Sephadex G50 至1ml 刻度处，将此柱置15ml 的离心管内，室温下，3000r/min 离心6min 。 b. 去除过柱后的液体，加入缓冲液重复离心直至柱内容物紧密充填至1ml 刻 度处，加100 μl 柱缓冲液，3000r/min 离心6min，重复洗涤步骤3 次。在最后一 步洗涤后，确保流量与上样缓冲液量相等，即100 μl 。 c. 探针溶液离心之前，放1.5ml 的反应管在注射器下方的15ml 管内，与前面 步骤相同，加探针液到柱内并离心，过柱后的液体收集在反应管中，这时已含有 20ng/ μl 的标记探针。该探针已可用于原位杂交或贮存于－20 ℃。 用缺口平移法进行地高辛标记 与缺口平移地生物素化法几乎相同，仅10×寡核苷酸母液成分不同： 0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5 mmol/L dGTP, 0.125 mmol/L 地高辛 -11-dUTP，0.375mmol/L dTTP 。 （三）斑点印迹分析法检测标记物 1．将分装的1 μl 标准DNA 稀释液和同法配制的 1 μl 待测DNA 稀释液点于硝 酸纤维素膜上。 2 ．硝酸纤维素膜置80℃真空烤箱内1h。 3 ．室温下，用AP7.5 缓冲液漂洗硝酸纤维素膜1min。 4 ．将硝酸纤维素膜密封于含10ml 封闭液的塑料袋中，置37℃温育30min 。 5 ．打开塑料袋的一端，弃去封闭液，加入新鲜配制的链亲和素-碱性磷酸酶交 联 物溶液，重封塑料袋口，置37℃温育30min 。 6 ．从塑料袋中取出硝酸纤维膜，用AP7.5 缓冲液漂洗 （室温下两次各5min ）， 再用AP9.5 缓冲液漂洗 （室温下10min）。 7 ．将硝酸纤维素膜重封于含显影液的塑料袋中 （33 μl NBT 溶于10ml AP9.5 缓 冲液中）。小心混匀后（不可漩涡混匀！）加入25 μl BCIP ，再次轻轻混匀反应液， 在37℃温育直至显影达满意程度，一般15～60min 。 8．从塑料袋中移去硝酸纤维膜，用TE 缓冲液终止显色反应。 9 ．空气干燥后，评估分析结果：测试组和对照组DNA 的颜色密度应进行比较。 中国试剂网 3.9.249 在理想的杂交结果，最低稀释度信号应当是可见的。 （四）荧光标记原位杂交探针的混合与变性 1．混合20～60ng 单拷贝DNA 和