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MDA含量测定 硫代巴比妥酸(TBA)法 ．植物生理[M]．北京：．200．(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．261-263) 一、原理 在酸性和高温条件下，丙二醛和硫代巴比妥酸反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收峰。但该反应受到可溶性糖和蛋白的极大干扰，可溶性糖和蛋白的吸收波长分别在450nm和600nm处。 植物组织器官的衰老总是伴随着细胞内膜的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来，研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的生物自由基(如O 2.-、OH.、1O2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。膜脂过氧化作用产生的自由基，它不仅能够连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合。从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老或死亡。膜脂过氧化作用可能以下列进行： 丙二醛 硫代巴比妥酸(TBA) 丙二醛 5,5’-亚丙烯苯-双硫代巴比妥酸(双TBA)(三甲川)·cm)]，并在600nm波长处有最小光吸收。可按公式： A532-A600=155000*C*L (1) 算出MDA浓度C(μmol/L)，进一步算出单位重量鲜重组织中MDA含量C(μmol/g)。式中A532和A600分别表示532nm和600nm波长处的吸光度值。L为比色杯厚度(cm)。 需要指出的是，植物组织中糖类物质对MDA-TBA反应有干扰作用。为消除这种干扰，经试验，可用下列公式消除有蔗糖引起的误差。 C(μmol/L)=6.452 (A532-A600)-0.56 A450 (2) 式中A450、A532和A600分别表示450nm、532nm和600nm波长处的吸光度值。用公式(2)可以直接求出植物样品提取液中MDA的浓度，进一步算出其在植物组织中的含量。 C(μmol/g)=[6.452 (A532-A600)-0.56 A450]*VT/(V0*W) (3) 备注：VT提取液总体积；V0测定液体积；W植物组织鲜重 二、材料、设备与试剂 (一)材料 植物组织器官(叶片等) (二)设备 分光光度计、水浴锅、研钵、精密电子天平、台式天平、试管、试管架、剪刀、量筒、烧杯、离心机、离心管10mL)、微量加样器1000μL)、移液管、镊子 (三)试剂 (1)%三氯乙酸(TCA三氯醋酸)：g定溶到100mL为%； (2)%硫代巴比妥酸(TBA)溶液：0.g的硫代巴比妥酸粉剂加入到%的三氯乙酸中定溶到100mL；三、方法与步骤 (1)分别取植株相应部位的材料0.2g，洗净擦干。(2)每次研磨前用量筒称取5ml蒸馏水,先取其中的2ml蒸馏水研磨,待研磨彻底后转移到离心管(10ml量程的),再分三次用量筒中剩下的3ml蒸馏水冲洗研钵,最后将离心管中的研磨液加到5ml为止. (3)再分别往各个离心管中加入0.5%的TBA 5ml，即最后每个离心管中共10ml液体。 （4）沸水浴10min，冷却后离心（3000rpm， 10min）。(3)算出单位鲜 重组织中的MDA C(μmol/g) 注意：对照管也要在100℃水浴上煮沸10min。 修改人:谢彩娜 2008-3-7