人胎盘醛还原酶的动力学和热力学性质.pdfVIP

第 l4卷 第 1期 湖南 医科大学学报 Vo114 N0．1 1989年 3月 BULLI门I『N 0FHUNAN M EDICALUNIVERSITY M ar． 1989 人胎盘醛还原酶的动力学和热力学性质 生物化学教研室 宋惠萍 提要 本实验 条件下，醛还 原酶的最适反应温度 为4O℃ ，在 25—45℃范围内，K．NADPH随蔷 度上升而增大，K 葡萄糖醛酸 (K D_G1)随温度上升而减 25U时 K N^DPH值 最 小，反应 活化 拒为 4521±653Cal／mol 温度越 高，Air1的△G 越 大 约 3／4的△G千用H维持过渡 态酶一底物 复合物 的空间构象，以增加分子 的有序程度 关键词 醛氧化还原酶类：砷力学；热力学；胎盘；人 类；生物化学 醛还原 酶 (EC 1。 1。 l。2，Aldehydereductase，Air1)是依赖还 原型辅酶 II (NADPH)的氧化还原酶，催化下列反应： 醛 (或酮)+NADPH = 相应的醇+NADP“”它在体 内参与醛的解毒反应。已有不 少有关动物和人的Alr1的报道表 明它遵循恒态有序顺序双底物一双产物动力学机制 0 。 但 Alrl的热力学性质及温度对此酶酶促反应的影响尚未见报道。本文报道温度对 Airl动 力学常数 的影响，并测定Airl的活化能 (Ea)，从基态到过渡态的 自由能变化 (△G )、 熵变 (AS )和热焓变化 (△H )。 材 料 和 方 法 一 、 材料 人胎盘取 自附属医院妇产科 ，清除胎盘结缔组织并用磷酸缓冲液 (PBS)清洗三次 ． DEAE一52系 Whatm．att公司产 品，PBE94树酯及 Polybuffer74系 Pharmacia公司产 品，其它试剂均系 Sigma公司产品。GilfordResponseⅢUV-VIS分光光度计系美国Gilford公司产 品。 二、醛还脯 的纯化 基本同Das法 0 ，但将DEAE一52层折中的 10mM PBS (pH7．0)缓冲液改 成 10mM HC1一咪唑 (pH7．0)缓冲液．用盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 Airl的纯度 ㈣ 。 三 、醛还原尊活性测定 按 Srivastava ”法在 25—45℃范围内测定酶活性 反应体系总体积 lml，含 200mM PBS (pH7o)反应缓冲液、D一葡萄糖醛酸 (D Lu)、NADPH和适量的酶。NADPH 的浓 度范围为OO卜01mM，D--Glu为 125—15raM．反应开始后扫描 340rim处光吸收降低．反应时间2rain， 反应温度 由循环恒温水浴控制。反应前将缓冲液、底物贮存液及酶溶液在其相应的反应温度预热 3rain。 四、醛还原酶和 NADPi-I的热稳定性测定 将酶溶液在 25-50~的恒温水浴 中保温，每隔 2miⅡ取出 一 定量的酶检测其活性 ，共测 10rain 在 25-50~恒温水浴中将 NADPH溶液保温 10rain，在 34Ohm处测 量保温前后NADPH溶液光吸收的改变。 五 数据处理 1988年3月10日收稿 功力学研究 醛还原酶的速度方程为 ¨ V— CA] [B] ’ K ^ [B] +K BCA3 +Kl^K B+ CA] CB3 (A：NADPH，B：D-Glu， K啪A： Alrl对 NADPH 的米 氏常数 ，KmB：Alr1对 D-Glu的米 氏常数+ ：Air1NADPH复合物解离常教，v… 为最大反应速度。)首先视 NADPH 为可变赢物 。固定 D--Glu，按 Lifiewcavcr—Burk法作图。得一系列直线+将各直线的纵截距对相应的 CD-Glu) 二趺作 图。可求得 K D 和 V 然后视 D—Glu为可变底物，固定 NADPH，再次按 Lineweaver-Burk法作 图+又得～系列直线+将各直线的斜率与纵截距与相应的 (NADPIfJ 二趺作困+可求得 K DPH K N^DPH及v… ．实验数据按Cleland。 计算机程序进行统计学处理．