米曲霉产中性蛋白酶高产菌株的选育及发酵条件优化.pdf

STUDY ON SCREENING OF HIGY-YIELD NEUTRAL PROTEIASE PRODUCING ASPERGILLUS ORYZAE AND FERMENTATION CONDITIONS A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science By Yuan Yanling Supervisor: Prof. Yang Shengyu May,2013 摘 要 中性蛋白酶是一类最适作用pH 为6.5～7.5 的蛋白酶，它能将大分子蛋白质水解为 肽类和游离氨基酸，被广泛应用于医药、食品和皮革等行业。 本论文以米曲霉H0 作为出发菌株，经紫外线、DES 复合诱变，通过干酪素培养基 筛选，得到一株中性蛋白酶高产菌株H2-5，其酶活力达到2158 U/g，传代培养10 代， 菌株遗产稳定性能良好。 确定了该菌株复合诱变的条件为：15 W 紫外灯照射，距离为25 cm ，照射时间为 120 s；DES 诱变浓度为2 ％，诱变时间15 min 。通过复合诱变，筛选出一株产中性蛋 白酶酶活力较高的菌株H2-5，其酶活较出发菌株提高了108.5 % 。 研究了发酵培养条件对菌株的产酶影响：其中碳氮源、培养时间、培养温度、料水 比及培养基初始pH 值等对酶活影响较大；活性剂、无机盐对酶活也有影响。通过单因 素实验确定了培养基组成为：碳源为麦麸、氮源为豆粕、碳氮比为4:1 、料水比为5:4， 确定了培养条件为：培养时间为84 h 、初始培养基pH 值为7.5、活性剂为吐温-80、无 机盐为KH PO 和Na HPO 、培养温度为30～32℃（前36 h 为32 ℃，后期温度为30℃）， 2 4 2 4 还确定了Ca2+对酶活的抑制作用。 研究了以单因素实验结果为参照，利用响应面实验来确定多因素对米曲霉产中性蛋 白酶的影响。通过响应面实验结果可知，发酵培养基的最适配方为：麦麸13.42 g，豆粕 3.45 g，料水比1.29，中性蛋白酶产量为5561.76 U/g，经过验证实验检测酶活力为5604 U/g，发现模型能比较好的预测实际发酵产酶情况。 研究了米曲霉高产菌株在大豆发酵中的应用，使其游离氨基酸量提高30 % 以上。 关键词：米曲霉，中性蛋白酶，诱变育种，发酵优化 I ABSTRACT The neutral protease is a protease whose optimum catalytic pH is 6.5～7.5.It can catalyze the cleavage of peptide bonds in protein and is widely used in pharmacy, leather and food. A series of mutations and screenings for higher enzyme producers were performed using the ultra violet (UV) and diethyl sulphate (DES) from parent strain Aspergillus oryzae H0. One high-yield neutral protease-produc