栉孔扇贝(Chlamys+farreri)血细胞酶联免疫检测试剂盒的研制和应用.pdfVIP

栉孔扇贝(Chlamys丘MP，f)血细胞酶联免疫检测试剂盒的研制与戍用 提升幅度和持续时间不及15℃。结果表明：血细胞在应激高温和p．葡聚糖刺激 过程中起着关键作用；而高温能削弱扇贝识别和结合外源刺激物的能力，从而增 加了被侵染的机率。 3抗各种类型血细胞的单克隆抗体的研制用Pereoll不连续密度梯度(10、 20、30、40和50％)离心法分离了栉孔扇贝全血细胞，吉姆萨染色和流式细胞 术鉴定了各层血细胞的成分，确定了30．40％界面层为透明细胞，而40．50％界面 层为颗粒细胞。分别收集透明细胞和颗粒细胞免疫小鼠，细胞融合，间接免疫荧 光法(IIFA)筛选，克隆，所得单抗再经流式免疫荧光法(FCIFA)和Western blotting 法(WBA)特性分析。结果显示：共筛选克隆得到7株既抗透明细胞和又抗颗 的单抗6H7，没有得到只抗透明细胞的单抗。单抗1F7的阳性率为82-|：2．4％，其 决定簇丰富，能与多个血细胞蛋白结合。单抗4D5的阳性率为76士2．3％，其中 PH占37+2．4％，PG占39-J：1．1％；它能与分子量为16．7，87和96kDa的血细胞 它能与分子量为16．7kDa的血细胞蛋白结合。单抗6H7的阳性率为62--L2．5％，· kDa的血细胞蛋白 其中PG占54+3．O％，PH仅占8+2．3％，它能与分子量为155 厶士厶 ；口口o 抗库中筛选单抗作为栉孔扇贝血细胞酶联免疫试剂盒的第一抗体。梯度稀释抗原 抗体，ELISA棋盘滴定法确定抗原抗体的最佳使用稀释度。高温(25℃)和病毒 (54AVNV)刺激栉孔扇贝，ELISA检测各刺激条件下的血细胞变化，以常温和 高温刺激的比较结果制定扇贝正常状态与受环境胁迫的临界范围，以未感染和病 毒感染的比较结果制定扇贝受环境胁迫与病原感染的临界范围，建立评估标准。 最后组装制备试剂盒。结果显示：单抗1F7具阳性率高，抗透明细胞和颗粒细胞， 及抗原决定簇丰富的特性被确定为试剂盒的第一抗体。抗原和抗体的最佳使用稀 正常范围；待检样品OD405啪值0．47+0．019，属病原感染范围；两者之间为环境 II 栉孔扇贝(Chlamysfarreri)血细胞酶联免疫检测试剂盒的研制与应用 胁迫范围。试剂盒包括酶标板，封闭液，单抗1F7，碱性磷酸酶(AP)标记的羊 抗鼠抗体，显色液，栉孔扇贝血细胞标准样品及检测结果评估标准等，其灵敏度 可达200 n咖lo irradians)颗粒细胞的交叉性，确定了单抗 yessoensis)、海湾扇贝(Argopecten 6H7能与这两种扇贝的颗粒细胞特异性结合，但不与透明细胞结合。将单抗6H7 选作为扇贝颗粒细胞酶联免疫试剂盒的第一抗体。分别梯度稀释栉孔扇贝、虾夷 扇贝、海湾扇贝抗原，梯度稀释单抗6H7，ELISA棋盘滴定法确定抗原抗体的最 佳使用稀释度。最后组装制备试剂盒。结果显示：不经稀释的抗原抗体具最佳的 结合效果。试剂盒包括酶标板，封闭液，单抗6H7，AP标记的羊抗鼠抗体，显 色液，三种扇贝血细胞标准样品等，其灵敏度可达5ixg／ml。 5扇贝血细胞酶联免疫试剂盒的应用于2009年3月至2010年1月，每月 中旬从山东地区采集栉孔扇贝，测完壳长后，取血，用试剂盒研究栉孔扇贝血细 胞变化与生长的关系。用5-4AVNV人工感染栉孔扇贝，感染后用试剂盒每天测 定颗粒细胞的变化，共测定9天。将海湾扇贝分成两组：一组每天实施投喂，另 一组则不投喂，用试剂盒每周测定两组扇贝颗粒细胞的变化，共测定5周。结果 显示：4，5，6月栉孔扇贝生长较快，对应的血细胞数量较多：8，9，10月生长 缓慢，对应的血细胞数量则少。病毒感染后第1天，栉孔扇贝颗粒细胞数显著升 高；随后急剧下降，于第3天达到最低值；之后开始回升，于第6、7天又显著 升高；最后恢复到对照值。饥饿胁迫后，海湾扇贝颗粒细胞数前3周呈依次显著 递减的趋势，3周后基本不再下降；投喂组的颗粒细胞数5周内基本维持同一水 平。测定结果表明本论文研制的试剂盒具较好的应用效果。 III 栉孔扇贝(Ch