眼镜蛇毒细胞毒素（CTX-b）的分离纯化、抗肿瘤作用及机制的研究.pdf

S-200Resolutin预装柱分离纯化。 HIigh 2 CTX．b的抗肿瘤活性 2．1 MTT法测定体外细胞毒作用 2．2对U14荷瘤小鼠瘤质量的影响 2．3形态学观察：荧光显微镜，电镜 2．4流式细胞仪DNA含量分析 3 CTX．b对线粒体功能的影响 3．1流式细胞仪测线粒体膜电位 3．2 3的变化 c及caspase9、caspase WeStem．blot测定胞浆cytochrome [结果] G．50柱层析得到4个峰，经小鼠毒性测定及分子 一、眼镜蛇粗毒经Sephadex S-200 HR预装柱 组分，其中组分Ⅵ经鉴定为CTX组分。将组分Ⅵ上Sephaeryl 不含PLA2。 在体内实验，CTX—b 率分别为22．5％及46．3％，具有显著性差异。体内外实验均显示TCTX．b强有 效的抗肿瘤作用。 三、首次研究CTX对人早幼粒自血病细胞--NB4细胞的促凋亡作用。荧光显 微镜、电镜下观察到，CTX．b(1．0 p．g／m1)作用于NB4细胞3h，即出现典型凋 亡改变：染色体凝集，核碎裂，凋亡小体形成等。流式细胞仪DNA含量分析， CTX—b出现明显的亚Gl期凋亡峰；作用6h， 作用3h，1．099／ml及1．59∥ml 三组剂量(CTX—b rtg／m1)均出现亚Gl期凋亡峰，并 O．59∥ml、1．09∥ml、1．5 与剂量成正相关。可见，致凋亡是CTX．b对NB4细胞的早期主要作用，且CTX．b 对NB4细胞的致凋亡作用具有剂量依赖及时间依赖关系。 四、首次证实CTX-b对NB4细胞线粒体信号通路的影响：CTX．b(1．0 I』g／m1) 作用0．5h，线粒体膜电位(A1Irm)已开始下降，在胞浆提取物中检测到 cytochrome c已由线粒体释放入胞浆，且△litm的下降与 c，显示c”ochrome 9酶 c的释放两者变化趋势相符。Westernblot结果显示，caspase cytochrome 3片断(17 原的含量在CTX，b(1．0¨g／ml作用1h时开始下降，而活化的caspase 9，CTX．b还可能通过其它途径激 kD)在0．5hBll检测到，表明除了通过caspase 3。 活caspase (109mol／L)及z—DEVD-fmk(109mol／L)对CTX—b(1．0lig／m1)诱导的NB4细胞凋 亡均有抑制作用，其caspase一3抑制剂一z．DEVD．fmk的抑制作用更明显。 [结论] 一、从眼镜蛇粗毒中分离获得CTX纯品——CTX．b，分子量为6，8kD，不含 PLA2，有利于正确评价CTX-b的抗肿瘤作用。 二、CTX．b对体内外肿瘤细胞均有明显的细胞毒作用。对NB4细胞6h的IC50 分别为1．8；ig／ml，与Shu 相比，CTX．b杀伤肿瘤细胞所需剂量小得多；在体内实验，CTX．bO．75及1．0 显著性差异，表明CTX-b对在体肿瘤同样具有明显的抑制作用。体内外实验 均显示了C1．X-b在抗肿瘤方面的应用价值。 三、首次研究CTX-b对人旱幼粒细胞白血病细胞--NB4细胞的促凋亡作用。 经形态学观察及流式细胞仪DNA含量分析，显示致凋亡是CTX．b对NB4细胞 的早期主要作用，且C