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酮洛芬前体药物经皮吸收的选择性及代谢机理研究 (摘要) 经皮给药制剂目前己成为药物制剂研究中非常活跃的一个领域。皮肤对大多 数药物是一道难以渗透的屏障，一般认为角质层是经皮吸收的主要屏障，目前的 研究主要集中在克服皮肤的角质层屏障作用和筛选药物经皮吸收促进剂等方面； 然而，皮肤也具有丰富的酶系统，药物经皮吸收过程中必然接触到生物转化体系， 可能会发生激活、失活或与组织成分反应等生物转化行为，因此研究药物在皮肤 中的生物转化对经皮吸收研究具有十分重要的意义。虽然国外有一些关于药物在 离体活性皮肤中生物转化的研究报道，但未见从离体活性皮肤、皮肤细胞及在体 皮肤三个方面进行经皮吸收过程中皮肤生物转化深入研究的报道。 手性药物目前是新药创新研究的热点。皮肤角质层系由可能提供手性环境的 角蛋白和神经酰胺等组成，手性药物与角蛋白的不同结合或与神经酰胺等的不同 相互作用可能引起对映体经皮渗透的差异，从而影响药物的临床疗效，因此手性 药物经皮吸收的选择性研究是一个令人瞩目的研究课题。有关在手性前体药物经 皮吸收过程中皮肤屏障的选择性渗透和代谢转化两方面的结合研究，国内外未见 文献报道。 本课题以临床常用的非甾体解热镇痛药酮洛芬为模型药物，合成一系列酯类 前体药物，从离体活性皮肤、皮肤细胞及在体皮肤三方面进行经皮吸收过程中皮 肤生物转化的深入研究，并从mRNA水平揭示皮肤羧酸酯酶代谢的分子机理。 通过本课题的研究，可为手性药物开发和前体药物透皮吸收制剂的研制提供理论 指导和技术借鉴。 本文建立酮洛芬、酮洛芬甲酯、酮洛芬乙酯、酮洛芬异丙酯的反相高效液 相色谱测定方法，具有前体药物和代谢物不经分离直接测定、标准曲线线性良好、 方法回收率和精密度都符合体内外经皮渗透和代谢实验测定需要等特点。采用 AGP手性柱建立酮洛芬对映体的反相高效液相色谱拆分、测定方法，标准曲线 线性良好，皮肤蛋白等杂质不干扰测定，方法回收率和精密度达到体外经皮渗透 和代谢实验的分析要求。 采用离体活性皮肤的表皮匀浆进行水浴温孵实验，考察酮洛芬前体药物的 皮肤代谢特征。人体表皮与不同种类动物表皮的酯酶代谢能力相差显著 (PO 05)，按蛋白含量校正它们的代谢能力依次为SD大鼠表皮长大二元杂交 幼猪表皮成人包皮的表皮，新西兰家兔表皮婴儿表皮。人体表皮代谢产物中以 R一酮洛芬为主，幼猪和家兔表皮代谢产物中也以R．酮洛芬占优势，但SD大鼠表 皮匀浆代谢产物中酮洛芬对映体的浓度未见差异(PO．05)，说明不同种类动物 表皮与人体表皮酯酶代谢的能力及选择性不同。 采用MTT比色法测定经皮吸收常用有机溶剂或促进剂对HaCaT细胞的毒 性，确定细胞培养代谢实验中有机溶剂的浓度。与对照组相比，2％以下浓度的 乙醇、丙二醇、异丙醇、正丙醇及二甲亚砜没有明显细胞毒性(P0．05)，而10％ 浓度时则有显著的细胞毒性(PO．05)，显微镜下观察发现很多细胞死亡，说明 细胞代谢实验中乙醇等含量应小于2％。 采用将酮洛芬和前体药物加入HaCaT细胞进行培养的方法，首次研究 HaCaT细胞的酯酶代谢特征。酮洛芬在HaCaT细胞不发生代谢和手性转化，酮 洛芬前体药物的HaCaT细胞代谢产物中以R一酮洛芬占绝对优势，尤其是酮洛芬 异丙酯的代谢产物中未检测到S-酮洛芬，酮洛芬甲酯、乙酯的水解速率接近 (PO．05)，酮洛芬异丙酯的水解速率最小，说明HaCaT细胞酯酶水解对R一酮洛 芬酯具有选择性，底物结构是影响酯酶代谢能力的重要因素，这也为酮洛芬对映 体的生物合成提供了一种新思路。 采用HaCaT细胞匀浆、表皮角质形成细胞匀浆及真皮成纤维细胞匀浆进行 水浴温孵实验，考察酮洛芬前体药物酯酶代谢的动力学。角质形成细胞的酯酶代 谢能力大于成纤维细胞的酯酶代谢能力。HaCaT细胞匀浆酯酶代谢的双倒数作 谢有抑制作用，且抑制作用随TPP浓度增加而增大，说明HaCaT细胞匀浆代谢 酮洛芬前体药物的酯酶属于羧酸酯酶。 采用外科手术和酶消化等方法体外分离皮肤，以水平式(两室)扩散池进 行酮洛芬和前体药物透过全皮、除角质层皮肤和真皮的离体渗透代谢实验。在经 离体裸小鼠全皮和真皮的渗透代谢实验中，酮洛芬前体药物经全皮渗透代谢的稳 态速率显著大于经真皮渗透代谢的稳态速率(PO．05)，酮洛芬前体药物经皮渗 透代谢实验结束后皮肤中的残留总量显著大于酮洛芬经皮渗透实验结束后皮肤 2