微孔板杂交法对肾综合征出血热早期诊断的应用的研究.pdfVIP

中文摘要 微孔板杂交法对肾综合征出血热早期诊断 的应用研究 摘 要 目的：探索建立一种敏感特异的早期诊断肾综合征出血 热的检测方法。 方法： 1从河北省各医院采集临床诊断为肾综合征出血热病人 的急性期血清，用间接免疫荧光法(IFA)检测血清中IgG 抗体； 2用间接免疫荧光法检测到的阳性鼠肺标本经漂洗、研 磨、过滤后制成病毒上清； 3从病毒上清或IFA检测HFRS阳性的病人血清中提取 汉坦病毒的总RNA，以RNA为模板，参考汉坦病毒的保守 序列设计引物并进行逆转录获得相应的cDNA； 4采用标记有生物素的上游引物经套式PCR进行扩增； 5扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定或用标记地高 辛的探针进行液相杂交，将杂交产物固定于包埋链酶亲和素 的微孔板中，经酶标抗地高辛抗体结合，底物显色，对杂交 结果进行鉴定。 结果： l实验方法的建立 1．1最佳反应浓度的确定 参照有关文献，用方阵法来确定最佳反应条件。以病毒 上清为标本，测定不同物质、不同浓度的OD值，计算出病 中文摘要 毒上清OD值与空白对照OD值平均值的比值，取比值最大 值时的条件作为最佳反应条件。最终确定的最佳反应条件 是：链霉亲和素浓度为10 地高辛碱性磷酸酶稀释度为1：2500。 1．2最佳反应时间的确定 随温育时间不同，实验最后目测颜色也不同，在一定时 间内随温育时间延长，目测颜色加深(由无色变为黄色)， OD值增大。实验结果取值时，以阳性数值在0．8一-．2．0之间， 空白对照OD值小于0．2，且阳性标本的OD值和空白对照的 OD值的平均值的差较大为标准来确定温育时间的长短。此 次实验温育时间是1小时。 1．3酶联免疫吸附试验阴阳性界限的判定 设置3孔空白对照作参照，计算空白对照OD值的平均 标准差。标本的OD值大于截断值，则判为阳性；如标本的 OD值小于截断值，可判为阴性；如标本的OD值在截断值 附近，则重复做3孔，取3孔OD值的平均值最后确定结果。 2方法学评价 2．1敏感性当扩增产物稀释1000倍时，微孔板杂交法 仍能判为阳性；而用凝胶电泳法检测，当扩增产物稀释lO 倍时，目的条带变得很弱，表明微孔板杂交法白太■善性为琼 脂糖凝胶电泳法的100倍。 2．2特异性取健康人血清20份，非HFRS的发热病人 血清16份，乙肝病人血清2份进行同步扩增，凝胶电泳分 析未见目的片断，扩增产物继续进行液相杂交，将杂交产物 固定于包埋链酶亲和素的微孔板中，经酶标抗地高辛抗体结 中文摘要 合，底物显色，对杂交结果进行鉴定，测定的OD值均小于 Cut．off值，可判为阴性。结果表明，微孔板杂交法具有较高 的特异性。 2．3重复性同一份病毒上清，在同一时间进行4管的微 孔板杂交实验，批内实验均值为1．214，标准差为0．076，变 异系数为0．063；同一份病毒上清，在不同时间l天，2天， 7天，1个月，3个月，6个月分别进行微孔板杂交实验，测 定6次，批间实验均值1．484，标准差0．311，变异系数为 方法具有较好的重复性。 3检测方法的应用 3．1血清标本IFA的检测 2007年共收集河北省各医院临床诊断HFRS病例血清标 l份。 本89份，经IFA检测血清中IgG抗体，其中阳性3 3．2不同病程的HFRS患者血清标本琼脂糖凝胶电泳法 检测 取HFRS阳性血清31份，进行RNA的提取，分别用I 型、II型特异型引物进行套式PCR。扩增产物用1．2％琼脂 糖凝胶电泳检测，结果有5份血清用II型引物扩增出目的条 带，阳性率为16．13％，用I型特异型引物均未出现目的条带。 3．3不同病程的HFRS患者血清标本微孔板杂交法检测 对扩增产物用标记地高辛的探针进行液相杂交，然后将 杂交产物固定于包埋链酶亲和素的微孔板中，经酶标抗地高 辛抗体结合，底物显色，对