携带HCC表位的HBc-VLPs的制备及其负载的DCs诱导抗原特异的细胞免疫应答和抗肿瘤效应的研究.pdf

中文摘要 诱导抗原特异的细胞免疫应答和抗肿瘤效应的研究 摘 要 目的 肝细胞癌(Hepatocellular 觅的恶性肿瘤，其发瘸率很高，严重藏胁人类健康龉HCC起 病隐匿，发生发展迅猛，手术切除率和术后生存率均较低， 所以～直以来它昀临床疗效和预后均不理想尊露蓠在手术、 化疗、放疗之盾辅以免疫治疗越来越受到医学界的重视。但 是，肿癌的低兔疫原链和祝体对肿瘤的低免疫反应性，使得 cells， 免疫治疗的应用受到限制。羁前，树突状细胞(dentritic DCs)的免疫呈递终霸在提离枧体对瓣瘪昀免疫反庭中得到 进一步认识，尤其是DCs细胞在快速诱导CD8+T细胞免疫记 能及诱导针对非优势抗原表位免疫应答等方面占有优势，因 ]褥DCs缨臆己成为研发瓣瘙疫营熬一个热点，新戮研制～种 有效的肝癌DC疫苗来激发机体的细脆和体液免疫应答以达 到控制就粪疾瘸鳃疆熬是疫蕾学急需勰决的趣题。 但是随着对肿瘤免疫治疗研究的刁≮断深入，人们逐渐认 识到，瓣癌细胞霹透过趣身的一些代谢产物傻蒲瘤宿主体内 DCs的数量、袭型及其功能发生异常变化，从而抑制DCs 的成熟和抗原遴呈功能，使机体撬肿瘤免疫受到抑制，使肿 瘤细胞得以逃逸免疫系统的监视作用#目前许多研究者应用 肿瘤抗原，如肿瘤特异性抗原、黔瘤相关性抗原及完全细胞 中文摘要 性抗原体外冲击致敏DCs，使其避开肿瘤的搠制作用，把经 过修饰的DCs疫苗输回体内，结果可以有效激发机体产生较 强的抗肿瘤免疫应答，但免疫应答一般不能维持。近期的研 究表明，这可能是由于抗原负载后的DCs的抗原递呈能力较 弱，或者负载抗原后DCs的寿命降低，因此很难诱导长效的 T细胞应答。 病毒样颗粒(virus．1ike 空壳结构，许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能 力。它在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免 疫原性和生物学活性。由于VLPs不含有病毒遗传物质，因此 不具有感染性，其中有些已经作为疫苗成功应用于临床。研 究表明，VLPs在没有任何佐剂的情况下即可诱导较强的细胞 与体液免疫应答，并可以通过交叉递里的方式将抗原袭位递 上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将 外源性抗原展示在其表面，这个特点就为人们研究疫苗提供 了更加广阔的前景。 黑色素瘤抗原(melanoma 睾丸和胎盘组织外均不表达，但在某些恶性肿瘤如肝细胞癌 白(AFP)是肝癌细胞分泌性蛋白，也是肝癌的特异性蛋白。 1—279 中文摘要 因至原核表达质粒pET28a中，在大肠杆菌中进行表达、纯化， 疫苗利用HLA-A2转基因小鼠对此DC疫苗的免疫效果进行 了评价，评价其诱导抗原特异的CD8+T细胞应答和抗肿瘤效 应，探索其作为兼具预防和治疗翳细胞癌作用的新型疫苗的 可能性。 方法 1．获得单袭位融合基因 利用巢式PCR技术获得四种抗原表位肽 HBc—M1、HBc-M3、HBc．A1和HBc．A2。 2．获得多表位融合基因 端，得到多表位融合基因HBc．S1和HBc。S2。 3．构建原核表达质粒pET28a．HBc．抗原表位 将上述六种融合基因连入原核表达载体pET28a，然后 克隆。抽提阳性克隆的质粒，进行测序。 4．HBc．抗原表位融合蛋白的获得 达，并通过改变IPTG浓度、诱导时间及葡萄糖加入量等条件 优化蛋白表达，匿的蛋霸主要以包涵体形式存在。蛋白经2M、 中文摘要 蛋白，经复性透析后得到嵌合病毒样颗粒蛋I兰tHBc．VLPs， 分析鉴定嵌合蛋白分子量大小及其抗原性和颗粒性。 用研究。 将制备的HBc．VLPs分别与体外培养的小鼠骨髓来源的 DCs共孵育，做细胞涂片并行细胞免疫荧光化学染色，用激 光共聚焦显微镜观察DCs胞浆内摄入的蛋白颗粒；通过混合 T细胞增殖。利用转基因