水牛γ-干扰素单克隆抗体制备及水牛结核病夹心ELISA检测方法的初步建立.pdf

生特异性反应，均具有良好的免疫活性。 Y作为双重筛选抗原建立间接ELISA方法，应用淋巴细胞杂交瘤技术，选取血清效 价高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经过3轮亚克隆筛选出2株能稳定分泌抗 定其重链均为IgGl型，轻链为K链，间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清效价均 解上清及其他重组蛋白反应，表明2株单抗均为针对水牛IFN．Y的特异性单抗。 3、以罗氏培养法培养牛结核分枝杆菌标准株AN5并提取DNA模板，采用重组 表达量约占菌体总蛋白的40％，并用HIS 分析显示：该融合蛋白能与牛结核阳性血清发生特异性反应。将重组的该融合蛋白用 于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血，可以产生高水平的IFN．Y。用Bovig一牛 型结核ELISA试剂盒检测结果与皮内变态反应反应对比显示，PPD抗原敏感性为 应检测牛结核阳性牛IFN．Y释放反应的准确度较低，混合感染牛可能被误判为结核 测具有良好的特异性。 4、利用筛选得到的两株抗水牛y．干扰素的单克隆抗体，对其中的一株纯化单抗 进行HRP标记作为检测抗体，另一株纯化单抗作为捕获抗体，建立检测水牛结核病 的Y．干扰素双单克隆抗体夹心ELISA。通过对封闭液、稀释液等条件进行优化，经 II 过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为625ng／mL，检测抗体的工作效价为 为5．6％7．07％，稳定性良好。采集60头单次皮内变态反应水牛肝素抗凝全血，利 放IFN．Y。用所建立的夹心ELISA检测所有样本，与皮内变态反应试验比较结果显 示，自制夹心ELISA方法检测水牛结核病的敏感性为81．81％，特异性为71．05％， 符合率为75％。该法的初步建立可作为皮内变态反应的辅助方法应用于水牛结核病 的检测，为将来摸清广西水牛结核病流行情况，制定相应的防控措施提供技术支持。 关键词：牛结核病，水牛，y．干扰素，原核表达，单克隆抗体，夹心ELISA III ofMonoclonalAntibodiesRecombinant Preparation against WaterBuffaloand ofDAS—ELISAfor IFN-7Development Bovine Tuberculosis Diagnosis Xu Xian-kun(Priventive veterinarymedicine) Directed andProf．Liu byProf．Zengxian-yin Qi ABSTRACT Bovine ac11romcbacterialdiseaseof tuberculosis(TB)iS animalsandhumanscaused bovis．Thediseasehasaworldwide byMycobacterium distribution．Incountries many bovineTBisstilla infectiousdisease domesticanimalsandthewildlife major among transmissiontohumansconstitutesa health population，and public problem．