氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化过程中TIF3+p36和研究.pdfVIP

广州医学院硕士论文 广州医学院硕士论文 广州医学院硕士论文 氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化 过程中TIF3 p36的研究六 硕士研究生：魏莲 导师：雷毅雄教授 中文摘要 目的 镉及其化合物是普遍存在的环境污染物和致癌物，但其致癌机制仍不是很清楚。 P和雷 在多阶段癌变过程中，翻译水平上的基因表达调控是一重要环节。近来Joseph initiationfactor 毅雄等鉴定发现鼠蛋白翻译起始因子3(Translation 3，TIF3)为 鼠的镉应答原癌基因TIF3，并发现TIF3在鼠细胞中呈现高表达。而鼠蛋白翻译起始 因子3与人的翻译起始因子eIF3p36有99％的一致性。然而JosephP等研究使用的 是鼠细胞，不能反映人细胞系接触镉之后其TIF3的实际表达情况。而且对人细胞来说， 它是否也是镉的应答原癌基因尚是一个值得探讨的问题。本研究拟在建立氯化镉转化 人支气管上皮细胞(16}IBE)模型基础之上，对氯化镉恶性转化16}IBE过程中不同阶段细 胞中的eIF3 p36mRNA的表达水平状况进行检测，为阐明镉的可能分子致癌机理提供 进一步的线索，同时期望为职业接触重金属人群的生物效应标志的寻找与筛选提供初 步依据。 方法 1．t molL、i0 1。氯化镉恶性转化16HBE模型的建立：经细胞毒性试验后，分别采用5 lamolL、15umol 1L浓度的氯化镉对非转化的16HBE进行染毒，每个剂量组两瓶． 染毒间隔时间为12天，每次染毒24小时，染毒lO次后，通过软琼脂集落形成试验 和裸鼠成瘤试验鉴定细胞恶性转化程度。 2．各阶段细胞中总RNA的提取：氯化镉恶性转化16HBE模型中三个剂量组的不同阶 段细胞经过含lO％d、牛血清的MEM培养液培养后，按TRhol试剂盒说明书对这些 细胞进行总RNA的提取，总RNA经无RNA酶的DNA酶处理以去除可能污染的DNA， 广州医学院硕士论文 u 在核酸定量仪下测定其浓度和纯度，并取5 l总RNA于2％琼脂糖凝胶电泳后，于 紫外分析仪下检测总RNA的完整性。 3．阳性定量标准模板的制备：采用中山达安基因公司自制逆转录试剂盒，提取对照组 cDNA 细胞的总E}NA，在普通PCR仪上进行RT—PcR扩增出翻译起始因子TIF3口36 片段。割胶纯化此片段，将此片段进行梯度稀释，以用作荧光定量PcR(FQ—PCR) 的阳性定量标准模板梯度。荧光定量采用灭菌三蒸水作为阴性对照。 4．Taqman荧光定量PCR检测TIF3p36 3900 基因序列，据此用Primerexpress2．0软件设计引物及探针序列，并在ABI 台式高通量DNA合成仪上合成该引物及探针。在引物作用下，将不同剂量组、不同 转化阶段的各细胞样品的总RNA中的目的基因mRNA片段进行逆转录后得其cDNA， 再将阳性定量标准品、阴性质控灭菌三蒸水及样品目的基因mRNA的逆转录产物 cDNA在PE7000全自动荧光定量PcR仪上、518nm荧光检测波长下，进行PcR扩 增，检测各阶段细胞的TIF3表达状况。 结果 1．镉恶性转化16册E细胞模型的建立 经氯化镉多次处理16HBE细