利用酵母三杂交系统筛选人胚海马cDNA文库以获得能够及FMRP发生相互作用的mRNAs.pdf

中国协和医科大学博士论文 摘要 研究背景 脆性x综合征是最常见的遗传性智力低下疾病之一，其发病率男性约为1／4000， 女性约为1／8000。临床上主要表现为中度到重度的智力低下，并常伴有巨睾、特殊面 容、多动症以及癫痫发作等临床病理表现。目前已证实脆性x智力低下基因 (FMRl)所编码的蛋白质FMRP的表达缺失是该病的致病原因，但具体的发病机 制尚不清楚。 结构域：KH结构域(核酸蛋白K同源结构域)和RGG框(精氨酸甘氨酸簇)【lI】； Localization 此外，还有一个核定位信号(Nuclear Sequence。NLS)和一个核输出信号 (NuclearSequence，NES)，可以使FMRP穿梭于细胞核与细胞质之间【7“。 Export RGG盒特异性的结合于一种称为G四集体(G quartet)的RNA分子内茎环结构【7l】； 这些都说明FMRP有多个位点参与了与靶RNA的相互作用【l纠4】，并且其靶RNA可 1mRNA[”、 能具有一定的序列特异性。已有研究证实FMRP参与部分靶基因如FMR ribosome transition factor∥1等的表达调控；FMRP protein$512饥、eukaryoticelongation 的结构特征也提示它的功能可能是参与其靶mRNAs从细胞核到细胞质，或从神经元 细胞质到树突和突触后的蛋白质合成位点的转运[1扣ls】；FMRP还可作为信使核糖核蛋 白复合体(mRNPs)的组份阮731，影响突触后及树突的具有翻译活性的多聚核糖体 的功能。有观点认为细胞内FMRP的功能模式可能是：通过其核定位信号被转运至 核内，入核后与数种蛋白质和特定亚群的mRNAs相互作用，形成mRNP复合体；然 后此复合体通过核输出信号输出至胞浆并定位于突触后位点。在此过程中，mRNP复 4 !望垫塑垦型查兰堕主笙壅 合体中的mRNAs一直处于无活性状态，直到突触的信号输入改变FMRP的活性，从 些靶mRNAs的翻译异常，从而导致一系列的临床病理表现。筛查并研究FMRP的靶 热点。 Brown实验室利用免疫共沉淀和微阵列分析的方法从鼠脑抽提物中确定了数百 在哺乳动物细胞系内发现了一系列的靶基因【69】。这两组筛查结果仅有部分相同，说明 筛查方法和研究对象的差异会对筛查结果造成很大的影响。而目前所进行的筛查实验 几乎都是利用体外(invitro)筛查的方法，且研究对象大多是实验动物或哺乳动物细 胞，与人体内的实际情况有较大的差异，难免会遗漏一些可能很重要的相互作用信息。 二研究目的 酵母三杂交系统是一种在酵母双杂交系统基础上发展而来的，可以快速检测 RNA．蛋白质相互作用的体内(invivo)筛查体系。它可以更加准确、更加生动地动 AF040097 态反映真核细胞内的相互作用情况。已有人利用该系统对FMRP与靶KNA 和AF040099的相互作用进行过研究167]，但是将该系统应用于大规模的筛查工作尚未 见报道。 我们希望利用酵母三杂交系统对人胎脑海马eDNA文库进行大规模的筛查，确定 在该体内(in 筛查结果将是一种有益的补充，并有可能筛选出新的有意义的相关致病基因。 三实验方法与实验结果 mRNA，逆转 本课题以19周胎龄的人胎脑海马总RNA为材料，分离得到l Itg 录合成平末端双链cDNA，琼脂糖凝胶电泳显示cDNA片段大小介于50Kb之 bp--3