内含子miRNA反馈调节其宿主基因表达和功能和研究.pdf

中文摘要 内含子miRNA反馈调节其宿主基因表达和功能的研究 硕士研究生：黄宝春 导师：邵宁生研究员 指导老师：曹国军博士 摘要 内源RNA，它们在组织发育和细胞分化的特定阶段表达，可以在转录后水平对 许多基因的表达起着重要的调控作用，参与发育、细胞增殖、凋亡、糖代谢、应 II启动 激和肿瘤的发生的生命活动。目前认为，大多数miRNA首先是通过pol 子转录，产生较长的，带有帽子结构和约80nt茎环结构的初始转录元 (pri．miRNA)，然后通过两种RNase 端7～8nt的种子区序列与靶基因的3’非翻译区序列的完全互补，介导靶基因 rnJ[矾A水平的降低或者抑制其蛋白的翻译。随着研究逐渐深入，各种IlliIWA的 功能越来越被了解。根据miRNA在基因组中的定位将其分为两类——基因间 编码蛋白基因(宿主基因)的内含子中，大多数的内含子miRNA与其宿主基因 的表达具有一致性，这就提示它们之间在功能上有一定的关联。文献也报道有一 些内含子miRNA能够反馈调节其宿主基因的表达和功能。本研究研究的目的就 是对这种反馈调节的普遍性进行进一步的探究。 本研究分主要为两部分： 能 肺癌是全世界癌症死因的第一位，而且每年死亡人数都在上升，因此肺癌成 为众多肿瘤中的研究热点。我们发现肺腺癌A549细胞中内含子miIⅢA．301表 表达下调，同时A549细胞的分裂指数增加和克隆形成能力降低，这与用silⅢA 敲除其宿主基因．‰2产生的效果相同，说明miRNA．301在表达和功能上反馈调 节其宿主基因。为找到miRNA．30l反馈调节其宿主基因的信号通路，我们首先 通过生物信息学确定miI斟A．301的直接靶基因——^扭似2，后续的荧光素酶试 III 中文摘要 的功能是抑制ERK信号通路。在A549细胞中由于miI埘A．301的高表达导致 施似2表达下降，进而ERK信号通路加强。EIⅨ信号通路的加强增加其下游 激活因子，CI汪B的活性增加从而导致上调鼢2的表达。同时还发现CREB还 基因的功能。CREB是肺癌发生中重要因子，由于它的活性增加导致其下游的相 关癌基因——如c≯s和咿』高表达，这可能是肺癌发生的一个重要原因。本部 分的实验结果一方面说明内含子miIⅢA．30l在A549细胞反馈调节其宿主基因 鼢2，另一方面为肺癌的发生提供一种可能的机制。 第二部分：内含子IIliRNA反馈调节其宿主基因表达现象的普遍性研究 我们第一部分的研究和已发表文献表明这种反馈调节可能有一定的普遍性。 直接验证内含子miRNA对其宿主基因功能上的反馈调节有难度，所以我们先从 其对宿主基因表达上的反馈调节入手。为验证这种普遍性，我们我们从Sanger 数据库将所有的miRNA下载，从中找出高度保守的内含子miRNA(大约65个)， 再参考锄bion的miRNA在常见癌细胞中表达谱，从中再找出在我们所选的五 列合成它们的抑制(二氧甲基化的反义寡核苷酸)。然后将这些抑制剂分别转染 上述五种细胞中，48小时后提总RNA，反转录，通过实时定量PCR检测它们宿 主基因的表达变化。实验的结果表达大部分的miRNA会对其宿主基因的表达产 生反馈调节，同时我们也发现在不同的细胞系中这种反馈调节的方向不同，譬如 miRNA．93却是反向反馈其宿主基因^纪^衫。这部分结果为内含子miIⅢA的存 在和功能提供了更好的理解。 关键词：miRNA．301；Ska2；内含子miRNA：反馈调节；普遍性 Ⅳ Theresearch aboutintronic miRNAsfeedback