小鼠体节期胚胎%3a定向造血的发育动力学与研究.pdf

中文摘要 中文摘要 胚胎造血发育一直是造血干细胞(hem stem a．copoieticcells，HSC)生物学的 研究热点，分为原始和定向造血两个阶段。后者以淋巴细胞和HSC的产生为标 志。近三十年来，对淋巴系统和HSC的起源认识由胚外的卵黄囊逐渐转移到胚 内的主动脉．性腺．中肾区(ao渤．90nad．mesonepllrosregio玑AGMregion，AGM 区)。Cm锄。等发现：胚胎循环建立前，胚内的脏壁层而非胚外的卵黄囊可通 过与基质细胞和胸腺组织块共培养在体外产生B和T淋巴细胞。然而，该结论 并未在其它实验室和通过其它培养体系得以验证。与淋系的体外分化系统相比， 通过移植和连续移植长期重建(4．6个月)致死剂量照射的成体小鼠的造血系统 是鉴定HSC的金标准。主流观点认为小鼠E10．5的AGM区是最早自主产生HSC 的位点。近期，研究者发现Hsc在胚外的胎盘组织出现的时间与AGM区几乎 相当，且在数量上显著多于AGM区，提示HSC的发生是多位点的。既往研究 发现：小鼠E9胚胎的头部含有典型的造血祖细胞，同时还表达SCL／Tal、GATAl 等造血标志。但是，该部位是否具有定向造血的潜能尚属未知。 本研究的第一部分，为明确能自主产生淋系的解剖部位，我们选取小鼠E8．5 胚胎(1．7体节)的卵黄囊(胚外)和脏壁层(胚内)作为实验对象，此时血液 循环尚未建立。在标准的集落形成实验中，两者均能产生典型的造血集落，但类 型有差异。通过OP9共培养发现：脏壁层可产生B淋巴细胞，它们表达B220、 体系均不能诱导卵黄囊产生B和T淋巴细胞。我们的研究表明：与卵黄囊相比， 脏壁层具有较强的体外淋系分化潜能。 本研究的第二部分，我们从髓系祖细胞、淋巴细胞、HSC三个方面比较了胚 酶消化成单细胞，按照一定的胚胎当量(embryoequivalents，ee)接种于造血集落 现E9．5小鼠头部细胞产生的造血集落多为红系且致密，而CFU．GM较少。E10．5 之后，CFU—GM明显增多。AGM区的粒单系集落形态均一，呈圆形或者椭圆形， 而头部的粒单系集落较大，细胞较分散，形状不规则。此外，我们还研究了 CH／AGM区和头部的髓系造血祖细胞(即CFU．C)的发育动力学，发现4个时 4 中文摘要 相比，E11．5头部的CFU．C数量显著增加达到高峰，之后又逐渐减少。利用磁珠 分选，发现AGM区和头部的CFU．C集中于Tie2+细胞群。上述结果表明：小鼠 胚胎AGM区和头部均存在髓系造血祖细胞，但两者在祖细胞的类型和发育动力 学等方面存在差异。 之后，我们考察了CH／AGM区和头部的淋系发育潜能。我们利用OP9基质 细胞共培养体系考察B细胞的分化潜能。在SCF、FL、IL．7等细胞因子的作用 下，第3-4天时OP9上有细胞簇出现，随后出现显著的半贴壁细胞扩增，其形态 类似淋巴细胞。第7．10天收集上述细胞进行流式细胞分析发现(代表性数据)： 的阳性率分别为：36．7％和25．8％。上述结果表明E9．5小鼠的CH和头部细胞均 具有B细胞潜能。同样，分离E9．5小鼠胚胎的CH和头部，利用磁珠分选获得 现OP9．DLl上有大量淋巴细胞样细胞增殖。在连续的4个时间点检测发现：随 着体外诱导时间的延长(7天、13天、19天、26天)，幼稚的T细胞前体 B+ 的比例均逐渐增加。至第26天时(代表性数据)，头部与CH的变化趋势基本一 致，上述3种细胞亚群的比例分别达到20．1％、7．5％、8．2％。上述结果表明：在 相同的诱导条件下，小鼠E9．5的CH和头部细胞均能够分化为T淋巴细胞，说 明两个位点均具有T淋巴细胞潜能。 最后，我们考察了AGM区和头部的HSC潜能。分离E12．5GFP转基因小鼠 胚胎的AGM区和头部，消化成单细胞后通过尾静脉进行移植。移植后5个月，