细胞膜磷脂PIP-%2c2-水解、细胞内钙释放及M通道功能关系和研究.pdfVIP

中文摘要 细胞膜磷脂PIP2水解、细胞内钙释放与M通道功能 关系的研究 摘 要 磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)广泛存在于各种真核细 胞的胞膜中，并主要分布于细胞膜靠近胞浆的内侧面。PIP2 虽然占细胞膜质脂的含量很少(不到1％)，但却作为细胞信 号转导过程中关键的调节因子，在包括产生胞内第二信使、 胞吐与胞饮调控、细胞骨架与胞膜贴附等一系列细胞的生理 过程及生命活动中发挥着重要作用。 PIP，是细胞信号转导通路中的关键调节因子，经磷脂酶 分别激活PKC与促使细胞内钙库释钙。目前越来越多的证 据表明，PIP：虽为信号通路中的上游分子，其本身亦作为一 种重要调节因子，参与了包括N型钙通道、多种电压依赖性 钾通道(Kir，KCNO等)的功能调控。 M通道电流作为一种慢激活、非失活的电压依赖型外向 钾离子电流，因其可被毒蕈碱受体(M受体)激活后所抑制， 神经节发现M电流后的近25年的时间里，人们对其调节机 制作了大量研究，已经发现众多与G。蛋白偶联的受体激活 后能引起M电流的抑制，信号通路的许多下游分子，包括 均被证实参与了受体介导的M电流抑制过程，但是其确切的 调节机制还是不得而知。M电流的抑制将导致神经系统兴奋 中文摘要 性升高。而M通道功能失调与良性家族性新生儿惊厥症 切关系。最近的研究表明，PIP2本身可以直接激活M电流， 而其水解则是受体介导的M电流抑制的原因之一。PIP：水解 后所引发钙离子释放则被证实在某些受体发挥对M电流的 调节中必不可少。 本实验将以爪蟾卵母细胞、}ⅢK293细胞及几种类型神 经元为研究对象，观察不同G。蛋白偶联受体激活后引起的 PIP2水解与内钙释放关系，进而研究这两种因素在M通道调 节过程中发挥的作用。 一、 在表达系统中观察细胞膜磷脂PIP：水解与细胞内钙释 放的关系 目的：研究卵母细胞中外源性表达的M，受体及BK2受 体激活后究竟是否引发细胞膜PIP：水解与胞内钙升高，并探 讨二者关系。此外，利用另一表达系统—-砸K293细胞，继 续探讨上述过程的机制。 化，体外转录成相应的cRNA，表达于卵母细胞中，双电极 电压钳观察由M。或BK2受体激动后诱发的钙激活氯电流； 共聚焦显微镜观察细胞膜PIP2水解情况；卵母细胞内钙离子 Calclium．鼬een．1 观察内钙浓度变化。脂质体法将M。受体，BK：受体， 细胞膜PIP2水解情况；F1uo．3负载，荧光标记细胞内钙离子， 共聚焦显微镜观察细胞内钙变化。 结果：(1)M。受体，BK：受体激活后，钙氯电流特征： 中文摘要 Cl一电流。当给予M，受体阻断剂阿托品后，Cl。电流不再出现。 同样诱导出cl’电流。若将卵母细胞事先孵育在含有1LlM 二者均不能引发Cl。电流。(2)LSCM观察卵母细胞内钙浓度 lmM 变化：向卵母细胞内直接注入23nL I陈可促使细胞内 钙释放，LSCM观察时，可看到快速诱发出的波及整个卵母 细胞的钙波。向表达M．受体的卵母细胞灌流ACh，LSCM 可观察到整个细胞范围出现钙波。向表达BK：受体的卵母细 针从胞膜向胞浆的转位，洗掉药物后，胞膜处荧光强度又逐 后再给予ACh，则观察不到胞膜荧光强度出现任何变化。(4) Ach后，可见到胞内 给药。在表达M1受体组，给予lO¨M b1·adykinin后，也 钙升高。在表边BK2受体组，给予100nM 可见明显见到荧光探针从胞膜处向胞浆处的转位。随着药物 被洗掉，胞膜处又重新有荧光聚集，而胞浆的荧光又会相应 减弱，呈现一种可逆性变化。 结论：(1)Ⅵ1受体、BK2受体激活后可诱导出卵母细胞 自身表达的钙激活氯通道电流，提示细胞内钙有升高，且这 中文摘要 种内钙升高绝大部分来自于卵母细胞内质网钙库钙释放。(2) 可以利用激光扫描共聚焦显微镜对卵母细胞内钙升高进行 观察。M。受体、BK2受体激活后均引起钙波在胞内的