芯片毛细管电泳分析生物样品的应用与研究.pdf

浙江大学博士掌位论文 摘要 生命科学是本世纪前沿科学领域之～，生命科学的发展离不开研究手段，特 别是是分离、分析、测试方法的创新。因此，生命分析化学已发展为当前分析化 学学科的前沿研究领域。 生物样品如DNA和单细胞等的电泳分析是生命科学研究领域中的重要组成 部分。在靶向药物的研究、疾病的早期诊断和治疗中有广阔的应用前景。由于芯 片毛细管电泳在分析速度和分离效率上比传统毛细管电泳都有了数量级的提高， 样品和试剂消耗量仅仅只有pL级，为生物样品的分析中提供了新的方法。 表面改性是提高芯片毛细管电泳分离生物大分子性能的关键技术。本文的目 的是建立玻璃芯片上长寿命、耐侵蚀的永久涂层的制作方法、用芯片毛细管电泳 究在芯片毛细管电泳同时测定单细胞内二种不同标记物质的方法。 本文第一章综述了毛细管电泳／微流控芯片的表面预处理和涂层技术、芯片 毛细管电泳分析DNA片段和单细胞内容物的现状和发展。 第二章研究了在玻璃微流控芯片上制作长寿、耐蚀的永久性涂层方法。为了 提高涂层的成品率，首次提出了用罗丹明123和荧光素钠的混合样的电泳迁移 时间来控制芯片徽通道预处理的效果，使不同来源、不同表面状态的芯片的在预 处理后硅羟基密度基本一致。进一步用甲醇和HCI的混合液在高温下处理芯片， 提高了玻璃表面硅羟基的产率。通过使用聚合线性聚烯酰胺、单体、引发剂的混 合液充入硅烷化的微流控芯片中，制得了耐蚀、高寿命的涂层。在弱碱性条件下 浸泡一周也未发现涂层性能降低；对未除盐的PCR产物也显示了抗侵蚀能力，在 此涂层进行了309次DNA分析，分析性能也未见下降。 第三章研究了微流控芯片上分析DNA片段的各参数，重点对筛分介质浓度、 电场强度、分离距离等做了优化，在优化的条件下对PCR扩增的单链抗体(ScFv) 片段做了分析鉴定。大大提高了分析速度，提高了鉴定DNA片段的准确度。 第四章首次将衍生剂NDA加入电泳缓冲液，动态标记了单细胞中的谷胱甘 肽。通过液压结合低电场进样，提高单细胞的进样速度和长期稳定性。细胞溶 浙江大掌博士掌位论文 高了分析速度。每小时可分析20个单细胞。通过对放置不同时期的同一血样进 行分析和数据处理，得到红细胞中的GSH的半衰期约为5天。 第五章在微流控芯片上同时测定单个红细胞中的谷胱甘肽(GSH)和活性氧 芯片上单细胞进样、贴壁、溶膜、衍生、分离和测定的集成化。首次提出了可以 防止单细胞电泳时细胞从细胞样品槽漏入分离通道微流控芯片的网络结构：优化 了细胞样品槽的结构，防止了由于细胞沉积而引起细胞进样速度降低。ROS和GSH 的检测限分别为0．5和6．9aIIlol，单细胞分析的通量为25celIs／h。由于本文的 检测限比毛细管电泳分析细胞提取液低2个数量级，首次同时测定了单细胞中的 定有助于检测和鉴定大量细胞中的少数不正常的细胞，在疾病的早期诊断中有应 用前景。 关键词： 微流控芯片；涂层：DNA：单细胞分析；GSH；ROS 浙江大掌搏士学位论文 Abstract Llfe iS theoneof frontierin this The science scientific century forthe for and ofitcalls advanced methods development analytical separation detectionof has biologicsamples．Accordingly，lifeanalyticalchemistry becomeoneof researchin the area important analyticalchem