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血管紧张素．(1．7)对心肌细胞缺血再灌注损伤的影响 血管紧张素．(1．7)对心肌细胞缺血再灌注 损伤的影响 专业名称： 心血管内科 硕士研究生：卢章 指导教师： 廖新学副教授 摘 要 动物实验与临床研究提示，心肌缺血再灌注损伤是常见的临床现象，心肌缺 血后在一定时间内恢复血液供应，可导致缺血心肌发生更严重的损伤，这种由再 灌注诱发的一系列有害反应，即为心肌缺血再灌注损伤，表现为再灌注性心律失 常、再灌注性心肌顿抑等，普遍存在于急性心肌梗死及其溶栓治疗、PTCA、 CABG、心脏移植等疾病状态和治疗中，对患者的预后和心功能恢复具有重要的 决定作用。大量的基础和临床试验表明，心肌缺血再灌注损伤是一个复杂的病理 生理过程，尚未完全阐明其机制。已有很多学说，目前认为，钙超载、氧自由基 的爆发产生是主要发病环节。此外，心肌纤维能量代谢障碍和细胞凋亡等均可能 参与缺血再灌注损伤的发病过程。 血管紧张素．(1—7)[Ang一(1—7)】是由天门冬氨酸、精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异 亮氨酸、组氨酸、脯氨酸组成的七肽生物活性物质。它是在体内由血管紧张素 I(AngI)和AnglI经内肽酶作用转化而成。近年来研究证实，肾素．血管紧张素系 统(RAS)的激活参与了心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程，心肌中血管紧张 II的生成或 II)水平的升高加重了心肌缺血与再灌注损伤，减少Ang 素II(Ang 拮抗其作用对心肌有保护作用。Ang一(1—7)是一种与前列腺素、缓激肽、一氧化氮 作用有关的，具有扩张血管、降低血压、调节水钠平衡以及抑制血管平滑肌细胞 增殖等拮抗AngII生理作用的生物活性物质。前期实验利用离体大鼠心肌缺血再 灌注模型探讨Ang一(1．7)对心肌缺血再灌注损伤的影响并探讨其可能机制。本课 血管紧张素．(1．7)对心肌细胞缺血再灌注损伤的影响 题将在乳鼠心肌细胞水平进行相关的实验。这种方法既能排除在体实验研究中存 在的血流动力学、激素、神经反射等其他因素的影响，亦能排除离体实验研究中 血管内皮因素的影响，能恰当反映Ang．(1—7)对心肌细胞本身缺血再灌注的影响。 这将为防治心肌缺血再灌注损伤提供新的理论和方法，为Ang．(1—7)进一步研究 提供实验依据。 研究目的 本课题通过建立乳鼠心肌细胞缺血再灌注模型，观察Ang一(1．7)对心肌细胞缺 血再灌注损伤的影响，并对其发挥作用的可能机制进行初步探讨。 方法 l、原代心肌细胞培养 参照文献方法分离心肌细胞，通过差速贴壁分离法纯化心肌细胞，使纯度达 到90％以上。首次换液为分离后24小时，以后每48小时换液。分离后的前72 小时培养基内需要添加BrdU。培养第5天的心肌细胞作实验用。 2、缺血再灌注模型的建立 以高纯氮气持续通气30分钟饱和无糖D-Hanks液作为缺血液；以纯氧持续 通气30分钟饱和含糖D-Hanks液作为再灌注液。模拟缺血时以缺血液分别灌注 各组心肌细胞，再将培养板放入密闭容器，并以10L／分钟流量的混和气体(95 ％N2和5％C02)充入密闭容器，持续20分钟，同时关闭进气口和出气口。到达 预计缺血时间后打开密闭容器，取出培养板，并将细胞培养液换为换再灌注液继 续作用相应时间。 3、细胞存活率测定 波长650nm。另设定空白对照为不加细胞只加培养液，空白孔调零。实验各组 IV 血管紧张素一(1．7)对心肌细胞缺血再灌注损伤的影响 均为6个复孔，每组重复3次。 100％ 细胞存活率(％)=实验组O．D．值／对照组0．D．值X 4、细胞凋亡检测 以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡情况。典型者可见染色质高 度凝聚、边缘化，进而细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 5、实验步骤以及分组 5．1确定缺血再灌注时间点 分别预设系列缺血时间和再灌注时间，观察不同时间细胞损伤的