牛布鲁氏菌Omp25基因的克隆与原核表达及其抗原特异性的研究.pdfVIP

摘 要 布鲁菌 (Brucella)是革兰氏阴性兼性的细胞内寄生菌，是一种由布鲁菌引起的人 畜共患传染病,给畜牧业的发展和人类的健康造成极大的危害。准确的诊断对有效控 制和消灭布鲁菌病是相当重要的，探索寻找合适的布鲁菌诊断性抗原一直是人们的目 标，所以具有免疫原性和抗原保护作用的布鲁菌外膜蛋白就成为了研究的热点。 本试验从 GeneBank 中下载编码布鲁菌外膜蛋白的基因，分析选取目前所有布鲁 菌基因序列同源性高的基因进行研究。通过分析选取了牛布鲁氏菌 A544 的Omp25 基 因对其进行初步研究，利用PCR 方法从流产布鲁菌基因组 DNA 中扩增出外膜蛋白基因 Omp25，大约 642bp 的基因片段，将目的基因片段用限制性内切酶EcoR I、Xho I 双 酶切后直接与经双酶切的表达载 pGEX-6p-1 连接，将该片段克隆于原核表达载体 pGEX-6p-1 中，之后将重组表达载体转化到大肠杆菌 BL21。重组载体的菌液经PCR 鉴定、重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定证明，成功扩增出了目的基因，并且将其成 功重组到了表达载体 pGEX-6p-1 中，重组菌在 0.5 mmol/L 的 IPTG 条件下诱导 4 h 时目的蛋白表达量达到了高峰。表达融合蛋白质分子量约为49kDa，以包涵体形式存 在。 提取包涵体后用电洗脱方法纯化融合蛋白，经 western-blotting 分析重组表达 融合蛋白 Omp25 的反应原性，发现该蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价 的抗血清。进而用B.suis S 作为菌体抗原包被,用所制的血清作为一抗，羊抗兔 IgG 2 为二抗。进行 ELISA 检测，进一步探索获得的蛋白作为诊断蛋白的可能性。 本试验成功构建了 pGEX-Omp25 重组载体，并通过 ELISA、Western-blotting 分 析及特异性检测试验，证明目的蛋白不仅具有抗原性且有良好的免疫反应。我们最终 用 ELISA 方法证明该蛋白质作为诊断性抗原的可能性，该结果为研究该蛋白功能和布 鲁氏菌诊断抗原奠定了基础。 关键词：流产布鲁菌 A544；外膜蛋白 25；原核表达；免疫特性 *项目来源： “十一五”国家重大科技攻关制成项目，（2006BAD4A16-4）主持人：吴树清 Cloning and Prokaryocytic Expression of Omp25 Gene of Brucella Abortus and Studies of Antigen Specificity Abstract Brucella is a Gram-negative facultative intracellular parasitic bacteria .It is a zoonotic disease that was caused by brucella SPP and severes affectting humans health and the development of animal husbandry. Accurate diagnosis is very important for effective control and eradication of the brucellosis and researching a suitable brucella diagnostic antigen is the aim of the people，Therefore, the Brucella outer membrane protein which is to immunogenicity and protective antigens is becoming researches focus. The gene of Brucella outer membrane protein was downloaded from GenBank.The gene was selected by analysis that showed hi