大鼠Nor-1在大肠杆菌中高效表达、抗体制备功能及研究.pdf

叁盟型!!!垄查墅堑堕主塑壶墼壅坠：垫竺型墨皇生堑堕壅 !塞塑墨 大鼠Noel在大肠杆菌中的高效表达、 抗体制备与功能研究 专 业： 药理学 硕士研究生： 肖茹 导 师： 颜光美教授 摘 要 中枢神经元凋亡是多种中枢神经系统疾病 如PD，AD，HD，ALS，脑缺血 继发性脑损伤 共同的病理学基础。因此，神经元凋亡与存活分子机制的研究对 这一类神经系统疾病的治疗具有重要的意义。目前，尽管许多诱导或抑制凋亡的 基因已被克隆和鉴定，发现了一些凋亡／存活通路，但由于终末分化的神经元具有 结构和功能上的特殊性，已有的知识并不能完全解释神经元调控凋亡的分子机制。 故此，神经元可能存在自身独特的凋亡调控机制，而探索凋亡新的分子机制和作 用机理是阐明神经元凋亡／存活分子机制的必由之路。 本实验室前期工作发现，大鼠Nor-1基因的mRNA在小脑颗粒神经元复极化 诱导凋亡时表达下调，而在重新去极化凋亡逆转时表达上调，提示其可能参与神 经元存活。通过腺病毒介导的Nor-1过表达可保护复极化诱导的小脑颗粒神经元的 凋亡，初步表明Nor-1具有神经元保护作用。为探索Nor-1在神经元中的功能及作 用机制，我们首先必须明确其在神经元损伤过程中蛋白表达的情况，因此作为工 具抗NOR-l抗体的制备是必须的。为此，我们运用原核基因融合表达系统表达 Nor-1的部分蛋白，以此作为抗原制备抗NOR．1多克隆抗体；使用这种抗体检测 Nor-l在小脑颗粒神经元低钾诱导的凋亡模型及缺氧模型中蛋白的表达情况，并在 的表达与神经保护及与神经元存活的关系。我们发现，这些药物在神经元损伤模 型中促神经元存活的同时，诱导Nor-1蛋白的表达上调，提示Nor-l可能参与这些 药物促神经元存活作用的信号转递。这些药物的神经元保护作用机制的研究已经 人鼠No卜I存人肠杆菌中的高效表达、抗体制备与功能研究 中文摘要 较为深入，而我们的实验为这些药物的神经保护机制的研究提供了新的线索和思 路。 抗NOR．1多克隆抗体的获得为Nor-1的生物学功能研究奠定了良好的基础。 作为新的促神经元存活的基因，明确Nor．1在小脑颗粒神经元损伤模型中蛋白表达 的情况为探索新的神经元保护信号转导通路打下基础。 第一章大鼠Noel在大肠杆菌中高效表达及其抗体的制备 选取Nor．1中能表达较好特异性及免疫原性蛋白的一段基因，构建其原核表达 性抗体。 方法采用PCR方法从插入有Nor-1 SK ． 质粒中扩增出 ORF的pBluescript ORF Nor．1 I／EeoR 346-888bp核苷酸，BamH I酶切后插入表达载体pGEX4％l， 表达。用Glutathione 4B纯化出来的GST-NOR．1融合蛋白免疫大白兔， Sepharose 制备抗NOR．1的多克隆抗体，采用WesternBlot进行特异性鉴定。 结果构建了GST-NOR一1融合蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中诱导其表 达，融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的33％，以大肠杆菌表达的GS％NOR一1 融合蛋白免疫动物成功制备高滴度、高特异性的抗NOR．1抗体。 结论利用GST-NOR一1融合蛋白免疫动物可获得高滴度的抗NOR．1的抗体， 为Nor-1的生物学功能研究奠定了坚实的基础。 第二章Noel在小脑颗粒神经元损伤模型中表达的研究 利用制各的抗NOR．1多克隆抗体探讨Nor-1在低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡 模型及小脑颗粒神经元缺氧模型中的表达情况，分别加入forskolin，NMDA受体 抑制剂MK801，及海洋甾体化合物YC．1等药物处理，观察药物对模型中No卜1 表达的影响。 方法大鼠小脑颗粒神经元的分离和原代培养：建立低钾诱导小脑颗粒神经元 台物YC一1等药物处理，倒置相差显微镜下观察细胞的形态学改变；二乙酸荧光索 Ⅱ 火鼠Nor-I在大肠杆菌中的l岛效表达、抗体制备与功能研究 中文摘要 muorescein diacetate，FDA 染色检测神经元的代谢活。l生 metabolicactivity $口存活率 gel bromide，EB 染色观察神经元 electrophoresis 及澳化乙锭 ethidium 泳 agarose 迹法检测NOR．1蛋白表达水平。 结果低钾培养或加入MK801后低钾培养24小时4,N颗粒神经元出现典型的 诱导的小脑颗粒神经元凋亡，Nor一1表达上调；小脑颗粒神经元在急性完全性缺氧 环境下出现明显的细胞肿胀而后坏死，细胞损伤程度与缺氧时间成『F相关，Nor-1 的表达随缺氧时间延长而逐渐减少；forskolin对神经元缺氧无保护作用，也不能使 细胞中Nor-1的表达上调。 结论Nor-1的表达与神经元的存