新生猪胰岛细胞的HLA-G1转染及其异种移植AVR的免疫活性细胞浸润的研究.pdfVIP

华中科技大学同济医学院 2001级博士研究生论文 摘 要 第一部分新生猪胰岛细胞的分离纯化和培养 目的探讨一种简单可行、高效的新生猪胰岛缅胞体外分离和培养的方法，为进一 步胰岛细胞的基因转染创造条件。方法胰腺来自出生3～5天的新生猪，在无菌条 连续密度梯度离心纯化，双硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛细胞，纯化的胰岛细胞在 检测胰岛细胞的胰岛素释放量。结果每头猪胰腺可以收获胰岛细胞2～3×105个 纯化的胰岛细胞；DTZ染色显示，胰岛细胞的纯度达90％以上：体外培养1周后， 胰岛细胞的活力正常：对不同浓度的葡萄糖液刺激，分泌的胰岛素量存在显著性 心纯化胰岛细胞，可以获得数量较多的，活力良好的新生猪胰岛细胞，为进一步 的实验提供了研究材料。 第二部分新生猪胰岛细胞的HLA-G，转染 目的HLA-G基因特异性表达在胚胎绒毛外细胞滋养层，在维持母胎耐受方面起 重要作用。HLA—G1基因表达NK细胞、T细胞以及树突状细胞的抑制性受体的配 体，诱导移植免疫耐受。本实验探讨脂质体介导HLA．G一基因转染体外培养的新生 猪胰岛细胞的可行性，分析其表达状况。方法采用第一部分方法即体外分离纯 化新生猪胰岛细胞，使用RPMI．1640培养基，在培养箱中，控制在37。C、5％CO， 条件下培养，隔日更换培养液。体外培养5天后，使用脂质体GeneJammer介导 HLA—G1基因转染胰岛细胞，间接免疫荧光法检测HLA-GI在胰岛细胞上的表达状 况。结果新生猪胰岛细胞HLA—GI表达率大约为53％，鼻外转染24～48h达高 峰。结论利用脂质体GeneJammer转染体外培养的胰岛细胞，可以获得靶基园的 瞬时高效表达。 华中科技大学蒯济医学院 2001级博士研究生论文 第三部分转染HLA—G，的新生猪胰岛细胞”cr实验 目的探讨脂质体介导的体外HLA—G、基因转染新生猪胰岛细胞后，目的基因 HLA．G。的表达对人NK细胞细胞毒的抑制作用。方法采用第二部分方法即体外 分离纯化的新生猪胰岛细胞．37℃、5％C02条件下培养箱中培养，隔日换液。体 的新生猪胰岛分别与人NK细胞共孵育，然后采用引Cr释放实验分析HLA．GI对人 NK细胞细胞毒的抑制作用。结果转染HLA．G1组和未转染组胰岛细胞溶解率分 利用脂质体 别为53．5％和71．57％，差异存在统计学意义(p0．01)。结论 细胞对猪胰岛细胞的细胞毒作用。 第四部分免疫活性细胞在猕猴接受异位猪心脏移植 急性血管性排斥反应中的意义 目的探讨免疫活性细胞在异种移植急性血管性排斥反应中的意义。方法猕猴接 受腹腔内异位猪心脏移植，使用高精度的CVF完全清除猕猴体内补体，获得AVR 模型。移植心遭排斥并停跳后手术切除，常规病理检查，并采用免疫组化法检测 达水平。结果移植心内大量淋巴细胞浸润，其中50％为巨噬细胞，CD4*T细胞占 导的排斥机制在异种移植AVR发生发展过程中发挥重要作用，采用针对T细胞活化 增殖的免疫抑制方案，有助于异种移植物的生存延长。 华中科技大学同济医学院 200]级博士研究生论文 Abstract Cells PART1 In OfNeonatalPorcineIslet vitroCulture To a methodstoobtainsufficientneonatal islets objective porcine investigatepractical invitro．Methods wereus