化学生物选性稀土元素标签和蛋白抟元素质谱绝对定量.pdf

摘要 摘要 作为蛋白质组研究的重要组成部分，定量蛋白质组学研究对于我们了解生命 系统动态而又复杂的运行过程具有重要意义。基于分子质谱的蛋白质定量技术虽 然在蛋白质组的相对定量中得到广泛的应用，但是，随着生命科学的发展，蛋白 质组的相对定量已经难以满足要求，发展蛋白质的绝对定量技术已追在眉睫。电 感耦合等离子体质谱(IcP．Ms)由于具有高灵敏度、宽的动态范围、同一元素 的不同形态具有相同的信号响应等优点，使它在蛋白质绝对定量研究领域显示出 很大的潜力。已有的基于ICP．MS的蛋白质定量研究表明，通过蛋白质分子中内 生的的S、P和Se以及各种金属元素，或者通过人工标记的外源Hg、I和镧系 等元素，都可实现对蛋白质的绝对定量，其中稀土元素以其极高的灵敏度和众多 可选元素／同位素的等特点显示出最大的潜力。由于基于ICP．MS的蛋白质定量 策略需要保证金属标记蛋白质的单一性，而目前的分离技术无法对整个蛋白质组 的所有蛋白质进行完全分离。因此在本论文中，我们将以发展特异性的稀土标签 核心，降低对色谱／电泳分离的依赖，使得利用ICP．MS对实际蛋白质组样品进 行定量成为可能，具体的研究工作将在本博士论文中一一阐述。本论文主要包括 以下六个部分的内容： 第一章主要对蛋白质和蛋白质组的相关背景知识进行了简要介绍，回顾和概 述了近几年来基于分子质谱和ICP．MS的蛋白质定量分析技术、策略和发展趋势。 第二章以双功能稀土螯合配体MMA—DOTA为桥梁，通过对标记条件的优 A)和溶菌酶 化，成功实现对胰岛素(msulin)，核糖核酸酶A(抽。肌clease 现对这3个蛋白质的绝对定量，并证明对完整蛋白质进行稀土标记与定量的可行 性。 第三章主要是以一种丝氨酸蛋白酶抑制剂4．2．胺乙基苯磺酰氟 (4一(2一锄ino砒y1)beIlzeneSulfonyl cheIIlis仃y)合成Eu标记的活性蛋白特异性标签(Ewopium．LabeledActivi妒Based 摘要 Probe)，成功地对多肽／蛋白质混合物中两种丝氨酸蛋白酶(s眺e proteases，SPs)， 一步将这一技术应用于人体血浆，以及雄性大鼠组织中活性SPs的研究，结果表 明这一技术不仅可以评估蛋白酶抑制剂的水平，还能够对生物组织中的差异表达 SPs进行绝对定量。 第四章结合光可裂解稀土标记酶活性标签、点击反应与纳米技术，我们建立 了一种集SPs的标记、纯化、富集与定量于一体的多功能活性蛋白质分析平台 (multifhnctioIlalactiVe proteinassay 在生理条件下具有良好的稳定性，在紫外光的照射下可以发生快速的光裂解。 第五章，利用蛋白酶专一性酶切多肽底物的原理，我们构建了稀土编码多肽 纳米粒子(Lanthallide-coded Peptide—Specifc 白质的非标记检测分析。由于ICP．MS可以分辨各种稀土元素，极大地降低光谱 重叠的影响，因此可以根据目标蛋白酶对应的不同底物，设计合适的LnPeNP标 签用于多种目标蛋白酶的高灵敏度同时定量检测。我们以奶，psin和cl啪ot聊siIl 为模型蛋白酶，对LIlPeNP标签进行系统评估，结果表明LIlPeNP在多种蛋白酶 的同时定量检测上具有方便、灵敏和准确等优点。进一步根据在细胞凋亡过程中 针，我们将进一步将这6个LnPeNP探针用于细胞凋亡研究。 第六章主要总结了本论文的研究内容和有待深入开展的工作，并对这一研究 领域的发展趋势进行了展望。 关键词：蛋白质定量；电感耦合等离子体质谱；稀土元素；丝氨酸蛋白酶特异性 稀土标签；半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶稀土标签 Ⅱ Abstrate Abstract Asan of