泛素连接酶Cbl家族调控乳腺癌内分泌治疗的分子靶向治疗敏感性机制的研究.pdf

·中文论著摘要· 泛素连接酶CbI家族调控乳腺癌内分泌治 疗与分子靶向治疗敏感性的机制研究 目的 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，内分泌治疗和分子靶向治疗是乳腺癌 的两个重要治疗手段。他莫昔芬(tamoxifen，WM)是雌激素受体拮抗剂，是乳 腺癌内分泌治疗的一线用药，肿瘤坏死因子相关调亡诱导配体(TNF-rclated apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是一种具有潜在l临床应用价值的靶向生物制剂 (II期临床试验阶段)。临床上大部分患者在应用TAM一段时间后发生继发耐药， 大部分乳腺癌细胞对TRAIL原发性耐药。研究TAM及TRAIL的耐药机制，探索 逆转耐药的新措施可为乳腺癌的内分泌及分子靶向治疗提供理论依据。 TAM主要通过竞争性与雌激素受体(estrogenreceptor，ER)结合，从而拮抗 雌激素，抑制ER阳性乳腺癌细胞增殖。研究发现乳腺癌细胞对内分泌治疗药物 的敏感性与细胞存活通路的活性密切相关，HER．2等细胞膜生长因子受体过表达 后可通过活化细胞内的存活通路导致细胞对TAM耐药，抑制细胞内存活通路的活 性可增强乳腺癌细胞对TAM的敏感性。最近研究发现TAM可以通过ER非依赖 的途径诱导ER阳性及阴性的肿瘤细胞凋亡，但是TAM诱导乳腺癌细胞凋亡过程 中细胞存活通路所发挥的作用尚不明确。本课题的第一部分将主要研究细胞存活 通路在TAM诱导乳腺癌细胞凋亡过程中所发挥的作用。 TRAIL通过与细胞膜上的死亡受体4(death 结合导致死亡受体通路起始因子Caspase．8的活化，最终导致死亡底物PARP等的 裂解，诱导细胞凋亡。既往研究发现乳腺癌细胞DR4／DR5的表达普遍较低或缺失， 副作用较大的化疗药物，如表阿霉素、紫杉醇、顺铂等可通过上调死亡受体的表 达增强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，但是副作用比较小的中药增强乳腺癌细胞对 TRAIL敏感性影响的报道尚少。本课题第’=部分选择传统中药蟾酥的有效成分蟾 响。 泛素蛋白酶体途径是真核细胞内选择性降解蛋白质的重要途径。c．Cbl和 Cbl-b是Cbl家族研究比较广泛的E3泛素连接酶，它们可以通过特异性选择底物 蛋白启动泛素化降解途径，参与膜受体表达及细胞内信号通路活性的负性调节。 本课题以乳腺癌细胞MCF．7细胞为模型，研究Cbl家族对细胞存活通路活性及 表达的调节及对TRAIL敏感性的调控。 材料与方法 1． 采用MTT法检测细胞活力，绘制细胞增殖曲线。 2． 采用流式细胞仪检测细胞膜表面DR4／DR5的表达，PI单染法进行细胞周 期分析、凋亡判定。 3． 采用Western 等蛋白的表达。 4． 采用RT-PCR方法检测DR4／DR5的mRNA表达水平。 5． 采用“pof＆t锄in占。枷2000试剂进行瞬时转染。 6． 统计学处理：每个实验重复3次，数据以均值士标准差(x士s)表示，两 组间差异采用t检验，P0．05有统计学意义。 实验结果 l、TAM抑制乳腺癌MCF．7细胞增殖诱导细胞发生凋亡 TAM以时间和剂量依赖的方式抑制乳腺癌MCF．7细胞增殖，24h、48h细胞 增殖抑制率达50％的药物浓度(IC50)分别为23．64-1．2M和14．44-1．1 p pM。流 式分析显示5肛M的TAM作用于MCF．7细胞24h后仅有4．1％的细胞凋亡，25斗M 的TAM作用于MCF．7细胞16h和24h后，分别有10．2％和20．1％的细胞凋亡． 提示TAM以时间及剂量依赖方式诱导MCF．7细胞凋亡。 2、TAM对细胞存活信号活性的影响及细胞存活信号在细胞凋亡 2 过程中发挥的作用。 以诱导MCF-7发生明显凋亡的TAM浓度(25 pM)作用于细胞不同时间后 检测c·Sre、Akt、ERK的表达及活性的变化。Westernblot分析结果显示MCF．7 细胞内有一定程度的基础c．