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WXXW 基序对ADAMTS13 分泌及功能的影响 中文摘要 WXXW 基序对ADAMTS13 分泌及功能的影响 中文摘要 ADAMTS13 ，又称为血管性血友病因子水解蛋白酶（VWF-CP ），是存在于血浆中的金属蛋 白酶，隶属于ADAMTSs （a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs ）金属蛋 白酶超家族。人ADAMTS13 基因于2001 年首次被克隆报导，定位于9 号染色体长臂端（9q34 ）。 基因全长37kb，主要由29 个外显子组成，其基因表达开放阅读框为4284bp，编码1427 个氨基 酸。ADAMTS13 蛋白主要由9 个结构功能域组成，从氨基端到羧基端依次为：信号肽、前导肽、 金属蛋白酶结构域、去整合素结构域、凝血酶敏感蛋白1 （TSP1 ）第1 基序、富半胱氨酸区域、 间隔区、凝血酶敏感蛋白 1 （TSP1 ）第2-8 重复基序、补体结合区域（CUB ）。ADAMTS13 主 要通过水解人血管性血友病因子（VWF ），降解血浆中超大分子量VWF 多聚体，使其对血小板 的黏附与聚集能力降低，从而抑制血栓形成。ADAMTS13 酶活性降低与血栓性血小板减少性紫 癜（TTP ）的发病密切相关。目前研究发现，ADAMTS13 金属蛋白酶结构域识别并水解VWF 蛋 白A2 区第1605 酪氨酸残基和 1606 位蛋氨酸残基间肽键。而ADAMTS13 金属蛋白酶结构域临 近的羧基端结构域，包括去整合素结构域、凝血酶敏感蛋白 1 （TSP1 ）第1 基序、富含半胱氨酸 结构域、间隔区，确保ADAMTS13 对VWF 的正确识别及有效的水解。 本文围绕ADAMTS13 的结构与功能进行研究，主要包括三个部分：1）构建了ADAMTS13 的TSR1 结构域中WXXW 基序突变体（W387A ），观察其对ADAMTS13 分泌及酶活性的影响； 2 ）构建了ADAMTS13-pEGFP-N1 绿色荧光真核表达载体，为研究ADAMTS13 细胞内合成及转 运过程提供有力的研究工具；3）获得了多株分泌抗ADAMTS13 的单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 以备进一步单克隆抗体分选及功能研究。 一、WXXW 基序对ADAMTS13 分泌及功能的影响 WXXW 基序在凝血酶敏感蛋白1 蛋白超家族中普遍存在，其中包括ADAMTSs 金属蛋白酶 家族。对于WXXW 基序的研究主要集中在凝血酶敏感蛋白 1 蛋白上，此基序被认为是凝血酶敏 感蛋白1 蛋白结合并活化TGF-β （transforming growth factor-β）所必需的。在对霍乱毒素分泌蛋 白EpsM 的研究中发现，WXXW 基序中芳香族氨基酸残基之间的相互作用可能与跨膜蛋白质的 二聚化有关。WXXW 基序在ADAMTSs 金属蛋白酶家族中普遍存在，然而，其功能尚未可知。 为了研究该基序的功能，我们构建了WXXW 基序的突变体W387A 的真核表达载体。 首先，我们用野生型ADAMTS13 及W387A 突变体的真核表达载体瞬时转染HeLa 细胞， 转染后48 小时收集培养上清及细胞。将浓缩后培养上清及细胞裂解液行SDS电泳及west blot ，通过灰度值测定判断上清及细胞裂解液中蛋白的含量。用培养上清中蛋白含量除以培养上 I 中文摘要 WXXW 基序对ADAMTS13 分泌及功能的影响 清及细胞裂解液中蛋白总量，计算蛋白的分泌量。实验结果表明：野生型ADAMTS13 上清中蛋 白含量为72.38% ± 10.70%，细胞裂解液中为27.62% ± 9.56% ；而W387A 突变体上清中蛋白含量 为20.46% ± 5.85% ，细胞裂解液中为79.54% ± 5.46% 。结果表明，W387A 突变抑制了ADAMTS13 的分泌，使得大量的ADAMTS13 蛋白积蓄在细胞内。蛋白细胞内定位实验结果显示，野生型蛋 白细胞内分布呈指环状，而突变体蛋白细胞内分布弥散，提示突变体蛋白更多地滞留在内质网中。 其次，我们构建了